Elucidation of significance and regulatory mechanism of glucose-mediated protein Arg-phosphorylation of glucose-metabolizing enzymes

阐明葡萄糖介导的蛋白质Arg磷酸化葡萄糖代谢酶的意义和调节机制

• 批准号: 21K05349
• 负责人: 小倉 光雄
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05349/
• 关键词: 転写因子; マンガンイオン輸送; RNA-seq解析; DNA結合; 転写制御; グルコース; リン酸化Arg; 細胞内Mn2+濃度; ピルビン酸脱水素酵素; リン酸化Arg脱リン酸化酵素; 転写因子; マンガンイオン輸送; RNA-seq解析; DNA結合; 転写制御; グルコース; リン酸化Arg; 細胞内Mn2+濃度; ピルビン酸脱水素酵素; リン酸化Arg脱リン酸化酵素

グルコース存在下でのahrC破壊株とmntR破壊株について、野生株を対照とした比較RNA-seq解析をN=4で実施した。その結果、ahrC株について、FDR, <0.05, log2[FC], 1の条件で、従来知られていたarg-boxを持つ8転写単位に加えて1176遺伝子を検出した。同じ条件でmntR株について、既知のマンガン輸送遺伝子7に加えて、1316遺伝子を検出した。予想していなかったが、ahrC制御候補遺伝子とmntR制御候補遺伝子は互いに3割程度重複していた。RNA-seq解析では往往にして偽陽性を標的遺伝子として検出してしまうことが知られているので、ahrC制御候補オペロンのプロモーターを15、mntR制御候補オペロンのプロモーターを19選び、両転写因子による制御を各プロモーターのlacZ fusionを作成・使用してグルコース存在下で検証したところ、全てについてその制御を確認した。なお14プロモーターについては、ahrC,　mntR両方で制御されていた。ahrCについては、カリウムイオンとマグネシウムイオン輸送に関わる遺伝子とヒスチジンなどのアミノ酸生合成遺伝子のプロモーターが含まれていた。また、mntRについては、鉄イオン輸送に関わる遺伝子とアルギニンなどのアミノ酸生合成遺伝子のプロモーターが含まれていた。両方ともspoIIEなどの胞子形成遺伝子をも制御していた。さらに精製AhrCとMntRタンパク質を用いて、これら転写因子が直接に上記の標的プロモーターに結合するか否かをEMSAにて検討した。その結果、AhrCについては新たに5プロモーター、MntRについては新たに12プロモーターについて直接の結合を観察した。

使用野生菌株在葡萄糖存在下对AHRC和MNTR破坏菌株进行了比较RNA-SEQ分析。结果，除了先前已知的8个带有arg-box的转录单元外，在FDR，<0.05，log2 [fc]和1的条件下，在AHRC菌株中检测到1176个基因。在相同条件下，除了MNTR菌株的已知锰转运基因7外，还检测到1316基因。尽管我们没有想到，但AHRC和MNTR对照候选基因彼此重叠。由于已知RNA-Seq分析在许多情况下可检测到误报作为靶基因，因此AHRC对照候选操纵子的15个启动子和MNTR控制候选操纵子的19个启动子的启动子，因此通过创建和使用每个启动子的LACZ融合来验证两个转录因子的控制，并证实了所有控制因子。此外，14个启动子受AHRC和MNTR的调节。对于AHRC，它包含参与钾离子和镁离子传输和氨基酸生物合成基因（例如组氨酸）的启动子的基因。此外，MNTR还包含参与铁离子转运和氨基酸生物合成基因（例如精氨酸）的基因。两者都调节孢子基因，例如spoiie。此外，使用纯化的AHRC和MNTR蛋白，我们研究了这些转录因子是否直接与靶启动子结合。结果，对于AHRC的5个新启动子和MNTR的12个新启动子观察到了直接结合。