高機能等温核酸増幅酵素の創製と構造解析および病原体の現場での迅速検出への応用

高性能等温核酸扩增酶的构建、结构分析及其在病原快速现场检测中的应用

基本信息

批准号：
22H03332
负责人：
保川清
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）を大腸菌で発現させ菌体から調製した。PKを使用したRPAは、従来から使用されているウサギクレアチンキナーゼ（CKr）を使用したRPAと同等の性能を有した。PKはCKrよりも高い耐熱性を有したことから、PKを使用したRPA試薬の高い保存安定性が示唆された。②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)から好熱性のPol（H1-PolとC1-Pol）を単離した。そしてH1-PolとC1-Polを大腸菌で発現させ菌体から精製した。H1-PolあるいはC1-Polを使用したRPAは、従来から使用されているBacillus stearothermophilus由来Pol（Bst-Pol）を使用したRPAよりも高い感度を有した。H1-Polを使用したRPAの凍結乾燥試薬は、少なくとも2週間室温に置いても、液状試薬と同程度の性能を有した。このことから、本凍結乾燥試薬は現場での使用に適していることが示唆された。③中温性のRecであるuvsYの溶解度を上げるために、Lys91-Glu134に変異を導入した全アミノ酸スキャニングライブラリーを作製した。600クローンをスクリーニングの結果、有望な変異体16種を単離した。

在本研究中，我们将介绍用于重组酶聚合酶扩增（RPA法）的嗜温重组酶（Rec）和单链DNA结合蛋白（SSB），这是一种等温核酸扩增方法，因其最适合现场检测而受到关注。通过总氨基酸扫描诱变方法提高了病原体、链置换DNA聚合酶(Pol)和ATP再生酶(ARE)的活性和稳定性。另一方面，我们的目标是从嗜热微生物中获得新的Rec、SSB、Pol和ARE，并比较它们的活性和稳定性。 ①人丙酮酸激酶（PK）是一种嗜温ARE，在大肠杆菌中表达并从细菌细胞中制备。使用 PK 的 RPA 的性能与使用传统使用的兔肌酸激酶 (CKr) 的 RPA 相当。 PK 比 CKr 具有更高的耐热性，表明使用 PK 的 RPA 试剂具有较高的储存稳定性。 ②从嗜热菌Aeribacillus pallidus (H1)和Geobacillus zalihae (C1)中分离得到嗜热Pol(H1-Pol和C1-Pol)。然后，H1-Pol和C1-Pol在大肠杆菌中表达并从细菌细胞中纯化。使用H1-Pol或C1-Pol的RPA比使用传统使用的嗜热脂肪芽孢杆菌衍生的Pol (Bst-Pol)的RPA具有更高的灵敏度。使用 H1-Pol 的 RPA 冻干试剂即使在室温下保存至少 2 周，其性能也与液体试剂一样。这表明该冻干试剂适合现场使用。 ③ 为了增加嗜温Rec uvsY的溶解度，我们创建了一个全氨基酸扫描文库，并在Lys91-Glu134中引入了突变。筛选 600 个克隆的结果是，分离出 16 个有希望的突变体。

项目成果

期刊论文数量（22）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

ヒトDNAポリメラーゼδのLeu606への変異導入がヌクレオチド選択に与える影響

人DNA聚合酶δLeu606引入突变对核苷酸选择的影响

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
石橋周侑;神田橋眞子;上野凛;滝田禎亮;保川清
通讯作者：
保川清

イチジク果実からのセリンプロテアーゼの精製と性状解析

无花果丝氨酸蛋白酶的纯化和表征

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
堀口星;床並実津希;上島直生;西村耕作;滝田禎亮;保川清
通讯作者：
保川清

Grimontia hollisaeコラゲナーゼのX線結晶構造と酵素活性の解析

Grimontia hollisae胶原酶的X射线晶体结构和酶活性分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
安本瑞貴;池内健晃;上島聡音理;滝田禎亮;田中啓友;楠畑雅;林田治;服部俊治;水谷公彦;三上文三;保川清
通讯作者：
保川清

シマグワ製品による αーグルコシダーゼの阻害

Shimagwa 产品对 α-葡萄糖苷酶的抑制

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
西本創;池田祐輝;喬穎;南秀明;伊東昌章; 木村俊之;滝田禎亮;保川清
通讯作者：
保川清

Comparison of the stability of CYP105A1 and its variants engineered for production of active forms of vitamin D

CYP105A1 及其设计用于生产活性维生素 D 形式的变体的稳定性比较

DOI：
10.1093/bbb/zbac019
发表时间：
2022
期刊：
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
影响因子：
0
作者：
Takita Teisuke;Sakuma Hiro;Ohashi Ren;Nilouyal Somaye;Nemoto Sho;Wada Moeka;Yogo Yuya;Yasuda Kaori;Ikushiro Shinichi;Sakaki Toshiyuki;Yasukawa Kiyoshi
通讯作者：
Yasukawa Kiyoshi