高機能等温核酸増幅酵素の創製と構造解析および病原体の現場での迅速検出への応用

高性能等温核酸扩增酶的构建、结构分析及其在病原快速现场检测中的应用

• 批准号: 22H03332
• 负责人: 保川 清
• 金额: $ 11.07万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03332/
• 关键词: リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法; リコンビナーゼ; 一本鎖DNA結合タンパク質; 鎖置換DNAポリメラーゼ; ATP再生酵素; 等温核酸増幅法; ピルビン酸キナーゼ; uvsY; 鎖置換DNAポリメ ラーゼ; リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法; リコンビナーゼ; 一本鎖DNA結合タンパク質; 鎖置換DNAポリメラーゼ; ATP再生酵素; 等温核酸増幅法; ピルビン酸キナーゼ; uvsY; 鎖置換DNAポリメ ラーゼ

本研究では、病原体の現場検出に最適と注目されている等温核酸増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（RPA法）で使用する、中温性のリコンビナーゼ（Rec）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、鎖置換DNAポリメラーゼ（Pol）、ATP再生酵素（ARE）の活性と安定性を、全アミノ酸スキャニング変異導入法により向上させる。一方、好熱性微生物から新規のRec、SSB、Pol、AREを取得し、活性と安定性を比較することを目的としている。①中温性のAREであるヒトピルビン酸キナーゼ（PK）を大腸菌で発現させ菌体から調製した。PKを使用したRPAは、従来から使用されているウサギクレアチンキナーゼ（CKr）を使用したRPAと同等の性能を有した。PKはCKrよりも高い耐熱性を有したことから、PKを使用したRPA試薬の高い保存安定性が示唆された。②好熱性細菌であるAeribacillus pallidus (H1) とGeobacillus zalihae (C1)から好熱性のPol（H1-PolとC1-Pol）を単離した。そしてH1-PolとC1-Polを大腸菌で発現させ菌体から精製した。H1-PolあるいはC1-Polを使用したRPAは、従来から使用されているBacillus stearothermophilus由来Pol（Bst-Pol）を使用したRPAよりも高い感度を有した。H1-Polを使用したRPAの凍結乾燥試薬は、少なくとも2週間室温に置いても、液状試薬と同程度の性能を有した。このことから、本凍結乾燥試薬は現場での使用に適していることが示唆された。③中温性のRecであるuvsYの溶解度を上げるために、Lys91-Glu134に変異を導入した全アミノ酸スキャニングライブラリーを作製した。600クローンをスクリーニングの結果、有望な変異体16種を単離した。

在这项研究中，嗜熟重组酶（REC），单链DNA结合蛋白（SSB），链脱落的DNA聚合酶（POL）和ATP酶（ATP）的活性和稳定通过使用一种引入所有氨基酸扫描的方法，对病原体的原位检测，等温核酸扩增方法，等温方法。另一方面，目的是获得新颖的REC，SSB，POL，并来自嗜热微生物，并比较其活性和稳定性。 1）人类丙酮酸激酶（PK），一种中嗜熟的大肠杆菌表达，并从细胞中制备。使用PK的RPA使用传统的兔肌酸激酶（CKR）具有与RPA相同的性能。 PK的耐热性高于CKR，这表明使用PK的RPA试剂的储存稳定性很高。 2）嗜热pol（H1-POL和C1-POL）是从嗜热细菌Aeribacillus Pallidus（H1）和Geobacillus Zalihae（C1）中分离出来的。然后在大肠杆菌中表达H1-POL和C1-POL并从细胞中纯化。使用H1-POL或C1-POL的RPA使用常规使用的固有型杆菌衍生的POL（BST-POL）具有比RPA更高的灵敏度。使用H1-POL的RPA的冻干试剂即使在室温至少保持2周时，也具有与液体试剂相似的性能。这表明冻干试剂适合原位使用。 3）为了提高中嗜性恢复的溶解度，准备了一个全氨基酸扫描文库，其中突变被引入lys91-GLU134。筛选600个克隆以分离16个有希望的突变体。