X線結晶解析と電子顕微鏡法による筋収縮制御の研究

利用X射线晶体学和电子显微镜研究肌肉收缩控制

基本信息

批准号：
20051024
负责人：
若林健之
金额：
$ 4.22万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

細いフィラメントの原子モデルの精密化を行った。これらの研究を行うための変異型アクチンのタンパク質は野口らによって開発されたシステム、即ち、アクチンのC端にヒスタグを付け精製し、その後、このタグを切除する方法で、ディクチオ型粘菌で大量発現し精製した。これらの構造データを統合するには,これまで目視によるドッキングが行ってきたが,精密化・客観化を目指して,分子動力学を用いて精密化した。しかし、蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)から得られる距離情報からイテラティブに蛍光団の三次元的位置を求めることができる距離幾何学法を使う必要はなかった。細いフィラメントの原子モデルを観察し、重合に対して重要な役割を果たすと考えられてアミノ酸に変異を導入したところ、実際に重合能が低下し、GFPを融合した変異型アクチンは細胞内での分布がより散漫であった。またATP分解に間接的に関与すると予測されたアミノ酸を変異させたところ、ATP分解活性が10倍以上となり、予測が裏付けられた。また同じアミノ酸を別のアミノ酸に変化させた際は、ATP分解活性が低下した。これらの変異体アクチンのX線結晶解析をおこなったところ、対応する構造変化が観察され、生化学的実験結果をよく説明出来た。ATP分解活性の増大の原因が分解反応速度の増大であって、ヌクレオチド交換の速度の増大ではないことを、ヌクレオチド交換速度を測定し、これが分解速度よりも数倍速いとの測定により確認した。ATP分解がマグネシウムを必要とする機構も示した。

我们改进了细丝的原子模型。这些研究中使用的突变肌动蛋白可以使用Noguchi等人开发的系统在盘基网柄菌中大量获得，其中His标签被附加到肌动蛋白的C末端，蛋白质被纯化，并且该标签被然后进行表达和纯化。到目前为止，视觉对接已被用来整合这些结构数据，但为了使它们更加精确和客观，分子动力学已被用来完善这一点。然而，不需要使用距离几何方法，该方法可以根据荧光共振能量转移（FRET）获得的距离信息迭代确定荧光团的三维位置。当我们观察细丝的原子模型并将突变引入被认为在聚合中起重要作用的氨基酸时，我们发现聚合能力实际上下降了，并且与GFP融合的突变肌动蛋白无法在细胞内发挥作用。分布较为分散。此外，当预测间接参与 ATP 降解的氨基酸发生突变时，ATP 降解活性增加了 10 倍以上，证实了这一预测。此外，当相同氨基酸变为不同氨基酸时，ATP降解活性降低。当对这些突变肌动蛋白进行X射线晶体学分析时，观察到相应的结构变化，这很好地解释了生化实验结果。通过测量核苷酸交换速度，确认其比分解速度快数倍，ATP分解活性增加的原因是分解反应速度的增加，而不是核苷酸交换速度的增加。。还显示了 ATP 分解需要镁的机制。