心筋ミオシン-アクチン相互作用の三次元クライオ電子顕微鏡法を用いた構造的研究

使用三维冷冻电子显微镜研究心肌肌球蛋白-肌动蛋白相互作用的结构

基本信息

批准号：
07266211
负责人：
若林健之
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

心筋ミオシン頭部で修飾されたアクチンフィラメントは溶液中で束をつくる.これは束形成速度が心筋ミオシン頭部では骨格筋ミオシン頭部で修飾されたものより速いためである.また,この束はMBS処理して重合能を奪ったアクチンモノマーを加える事により阻害されることを光散乱を用いて示した.我々はクライオ電子顕微鏡像からの三次元再構成により,このメカニズムを研究した.心筋ミオシン頭部で修飾されたアクチンフィラメントと,MBSアクチンを加えたものを液体エタンで急速凍結し,電子顕微鏡像を撮影した.この方法は染色・固定を行う場合に比べ,試料を生のまま観察できるという特色がある.撮影に用いた電子顕微鏡は冷電界放射型電子銃を装備した日立HF2000で,従来の電子顕微鏡に比べて高いコントラストを得られ,氷包埋の試料の観察に威力を発揮することを既に示している.得られた電子顕微鏡写真をCCDカメラで計算機に取り込み,試料のらせん対称性を利用して三次元構造を求めた.その結果,MBSアクチンを加えた試料には,心筋ミオシン・アクチンだけからなる試料には見られない構造が見られた.これはミオシンの軽鎖ドメインの先端に相当する.この構造が加えたMBSアクチンであるとすると,ミオシン軽鎖ドメインにMBSアクチンが結合することが示されたことになる.隣り合ったフィラメントのミオシン同士,またはミオシンとアクチンが相互作用して出来た束が,MBSアクチンによって阻害され,束が解ける様子がはじめてクライオ電子顕微鏡法で可視化されたといえる.軽鎖ドメインとアクチンの相互作用はミオシンとアクチンの滑り運動に直接関係あるものかどうか現在論争中であり,滑り運動におけるミオシン軽鎖の役割は大きな関心を集めている.この研究が心筋ミオシンのみならず,滑り運動一般のメカニズムにインパクトを与える可能性は大いにあるであろう.

用心肌肌球蛋白头修饰的肌动蛋白丝在溶液中形成束，这是因为在MBS处理后，心肌肌球蛋白头修饰的肌动蛋白丝的形成速度比用骨骼肌肌球蛋白头修饰的肌动蛋白丝更快。我们使用光散射来表明添加剥夺了肌动蛋白的肌动蛋白单体将含有MBS肌动蛋白和MBS肌动蛋白的样本快速冷冻在液体乙烷中，并拍摄电子显微镜图像。与使用染色和固定的电子显微镜相比，该方法具有允许以原始形式观察样本的优点。使用冷电场。我们已经证明，配备发射型电子枪的日立 HF2000 可以获得比传统电子显微镜更高的对比度，并且可以有效地将其带至使用 CCD 相机的计算机上观察冰包埋样品。利用样品的螺旋对称性确定三维结构，结果，添加了MBS肌动蛋白的样品具有仅由心肌肌球蛋白和肌动蛋白组成的样品中所没有的结构，即肌球蛋白灯的尖端。链域。如果该结构是添加的 MBS 肌动蛋白，则表明 MBS 肌动蛋白与肌球蛋白轻链结构域结合。首次利用冷冻电子显微镜可视化相互作用形成的束，该束被MBS肌动蛋白抑制，然后被解开。轻链结构域与肌动蛋白之间的相互作用与肌球蛋白的滑动直接相关肌球蛋白轻链在滑行运动中的作用目前正在争论中，而肌球蛋白轻链在滑行运动中的作用引起了人们极大的兴趣。这项研究不仅对心肌肌球蛋白的机制产生影响，而且具有巨大的潜力。还涉及一般滑行运动的机制。