高分解能蛍光顕微鏡法によるカルシウムスイッチングの動的観察

使用高分辨率荧光显微镜动态观察钙转换

基本信息

批准号：
19037023
负责人：
若林健之
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

骨格筋・心筋の収縮は細いフィラメントへのカルシウム・イオンの結合で制御されており、その標的タンパク質はトロポニンである。これまで, トロポニンの三者複合体のNMR分光を行い、トロポニンにはモバイル・ドメインの原子構造を解くことに成功し, この構造情報から筋弛緩の際のアクチン・トロポニン結合の原子モデルを構築した。このモデルによれば, トロポニンがトロポミオシンを押すことによって, アクチンのミオシン結合部位を覆うことが, 弛緩の分子メカニズムである。そこで, 本研究ではカルシウムがトロポニンに結合・解離する際のトロポニンおよびトロポミオシンの動きを動的に観察することを目的とした。まずトロポミオシンを大腸菌で大量発現・精製する方法を確立した。次いで、トロポミオシン全体にわたってほぼ均等に7箇所にシステイン残基を導入することに成功した。東北大学樋口研の協力の下でQドットアビジンを結合させてその動きを観察した。ケージドEGTAの紫外線照射によりカルシウムの濃度を下げると, Qドット蛍光は移動したように見えたが、紫外線照射の際の振動などのアーテファクトである可能性もあるので慎重に実験を繰り返す必要がある。またアクチンフィラメントがしっかりとガラス基板に結合できていない可能性も検討している。導入したシステインをビオチン化し、Qドット標識アビジンを結合させようとしたところ、その結合効率は、システインを導入した部位に依存して大きく異なるという予想外の結果も得た。

骨骼肌和心肌的收缩是通过钙离子与细丝的结合来控制的，目标蛋白是肌钙蛋白。到目前为止，我们已经对肌钙蛋白三元复合物进行了核磁共振波谱分析，并成功解析了肌钙蛋白移动结构域的原子结构，根据这些结构信息，我们构建了肌肉松弛过程中肌动蛋白-肌钙蛋白结合的原子模型。根据该模型，松弛的分子机制是肌钙蛋白压迫原肌球蛋白，从而覆盖肌动蛋白的肌球蛋白结合位点。因此，本研究的目的是动态观察钙与肌钙蛋白结合和解离时肌钙蛋白和原肌球蛋白的运动。首先，我们建立了在大肠杆菌中大规模表达和纯化原肌球蛋白的方法。接下来，他们成功地在整个原肌球蛋白的七个位置几乎均匀地引入了半胱氨酸残基。在东北大学樋口实验室的合作下，我们结合了Q-dot亲和素并观察了其运动。当笼式EGTA的紫外线照射降低钙浓度时，Q点荧光出现移动，但这可能是紫外线照射期间的振动等伪影，因此必须仔细重复实验。我们还考虑了肌动蛋白丝未紧密结合到玻璃基板上的可能性。当引入的半胱氨酸被生物素化并尝试结合Q-dot标记的亲和素时，得到了意想不到的结果：结合效率根据引入半胱氨酸的位点而有很大差异。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Structural basis for Ca^<2+>-regulated muscle relaxation of striated muscles at interaction sites of troponin with actin and tropomyosin.

Ca^2调节肌钙蛋白与肌动蛋白和原肌球蛋白相互作用位点的横纹肌肌肉松弛的结构基础。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Adv. Exp. Med. Biol. 592
影响因子：
0
作者：
K.;Murakami・F.;Yumoto・S.;Ohki・T.;Yasunaga・M.;Tanokura・T.;Wakabayashi
通讯作者：
Wakabayashi

トロボミオシン・ジャンクションのスイベルはアクチンフィラメント制御に必須である

肌球蛋白连接旋转对于肌动蛋白丝的调节至关重要

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
村上健次;M.;Stewart;若林健之
通讯作者：
若林健之

Evaluation of a 2k CCD camera with an epitaxially-grown CsI scintillator for recording energyfiltered electron crvomicrogranhs

使用外延生长的 CsI 闪烁体记录能量过滤电子显微镜的 2k CCD 相机的评估

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
J Electron Microsc. (Tokyo) 57
影响因子：
0
作者：
K. Murakami;M. Stewart;K. Nozawa;K. Tomii;N. Kudou;N. Igarashi;Y. Shira kihara;S. Wakatsuki;T. Yasunaga;& T. Wakabayashi;Tomoyuki Mori;T. Yasunaga & T. Wakabayashi
通讯作者：
T. Yasunaga & T. Wakabayashi

Tropomyosinbinding Motifs of Actin

肌动蛋白的原肌球蛋白结合基序