心筋ミオシン-アクチン相互作用の三次元クライオ電子顕微鏡法を用いた構造的研究

使用三维冷冻电子显微镜研究心肌肌球蛋白-肌动蛋白相互作用的结构

基本信息

批准号：
08258209
负责人：
若林健之
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、心筋細胞の主要タンパク質であるミオシンとアクチンの相互作用を、三次元クライオ電子顕微鏡法を用いて、分子レベルで構造学的に解析することを目的として進められた。我々は、クライオ電子顕微鏡法・三次元再構成法を用いて、心筋の場合には特徴的なアクチン-ミオシン相互作用を行っていることを示した(石川ら、1995)。更に、我々は、この特徴的な相互作用を解明するために、個々のタンパク質を可視化し、そのタンパク質間相互作用の様式を明らかにすることを目的として、ホログラフィック像再構成法を開発した。これにより、我々は、生きたミオシン単一分子の可視化に成功した。ヌクレオチドを結合していないミオシン頭部、ADPやADP・Piを結合した頭部を可視化し、そのことを生物物理学会にて報告した(安永ら、1996)。また、個々のミオシン頭部と、X線結晶解析から得られた原子モデルとを比較し、軽鎖結合部位やアクチンクレフトなどサブドメインを観察できた。すなわち、我々が得たミオシン頭部のホログラフィック像からの再構成像は、高い分解能と十分なコントラストを持つ。かくして、我々は、タンパク質単一分子を可視化し、ナノレベルの構造を十分に議論することができるホログラフィック像再構成法を開発できた。この手法を応用することにより、ミオシン頭部とアクチンとが相互作用している現場を捉え、生物物理学会にて報告した(橋場ら、1996)。収縮状態では、ミオシンとアクチンが様々な角度で相互作用し合っていた。このことは、我々に、滑り運動中のアクチンミオシンがその相互作用部位を変化させながら、滑り運動を起こしているという新しいモデルを示唆させる。かくして、我々は、ホログラフィック像再構成法を心筋のアクチンミオシンに適用することにより、心筋の特徴的なアクチン-ミオシン相互作用のメカニズムの解明に、電子顕微鏡を使った構造学の面から迫ることができる手法を手にした。また、心筋は骨格筋と同様に、カルシウムにより制御されている。我々は、タンパク質工学の手法を用いて変異アクチンを作製し、アクチンとトロポミオシンの結合部位を明らかにし、Riochemistry誌に報告した(佐伯ら、1996)。変異アクチンの一つは、野生型よりも、より高い協同性を持つ筋収縮制御能をもつ(佐々木ら、1997)。こうした変異アクチンの解析により、心筋の収縮制御に関わる因子を明らかにすることができる。

本研究的目的是使用三维冷冻电子显微镜在分子水平上结构分析肌球蛋白和肌动蛋白（心肌细胞中的主要蛋白质）之间的相互作用。使用冷冻电子显微镜和三维重建，我们证明心肌具有特征性的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用（Ishikawa 等，1995）。此外，为了阐明这种特征相互作用，我们开发了一种全息图像重建方法来可视化单个蛋白质并阐明蛋白质-蛋白质相互作用的模式。通过这个，我们成功地观察到了一个活的肌球蛋白分子。我们对不结合核苷酸的肌球蛋白头部和结合 ADP 或 ADP/Pi 的肌球蛋白头部进行了可视化，并在日本生物物理学会上报告了这一点（Yasunaga 等，1996）。此外，通过将单个肌球蛋白头与 X 射线晶体学获得的原子模型进行比较，他们能够观察轻链结合位点和肌动蛋白裂隙等子域。也就是说，我们获得的肌球蛋白头部全息图像的重建图像具有高分辨率和足够的对比度。因此，我们能够开发出一种全息图像重建方法，使我们能够可视化单个蛋白质分子并充分讨论纳米级结构。通过应用这种方法，我们捕获了肌球蛋白头和肌动蛋白之间的相互作用，并将其报告给日本生物物理学会（Hashiba et al., 1996）。在收缩状态下，肌球蛋白和肌动蛋白以不同角度相互作用。这提出了一种新模型，其中肌动蛋白-肌球蛋白在改变其相互作用位点的同时进行滑动运动。因此，通过将全息图像重建应用于心肌肌动蛋白-肌球蛋白，我们将使用电子显微镜从结构角度阐明心肌中特征性肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的机制。此外，与骨骼肌一样，心肌也是由钙控制的。我们使用蛋白质工程技术创建了突变肌动蛋白，阐明了肌动蛋白和原肌球蛋白之间的结合位点，并在《Riochemistry》中报道了这一点（Saeki et al., 1996）。一种突变型肌动蛋白能够以比野生型更强的协作性控制肌肉收缩（Sasaki 等，1997）。对这种突变肌动蛋白的分析使得阐明参与心肌收缩控制的因素成为可能。