拡張型蛋白質合成系を含む細胞システムの構築

包括扩展的蛋白质合成系统的细胞系统的构建

基本信息

批准号：
20034036
负责人：
大槻高史
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本課題では、拡張型蛋白質合成系(蛋白質へ非天然アミノ酸を導入する系)を含む細胞システムを構築すること、および、拡張型蛋白質合成系を含む人工細胞システムを構築することを目的とする。本年度は、以下について研究を行った。1) 細胞内で非天然アミノ酸を含む蛋白質を合成するシステムの開発:細胞内で非天然アミノ酸を含む蛋白質の合成を行うため、アミノアシルtRNA(ここでは、非天然アミノ酸を担持したtRNA)の細胞内導入法を検討した。リポフェクション、マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーション法でアミノアシルtRNAは細胞内に導入できるものの、細胞内での蛋白質合成には極めて低い効率でしか使われないことが分かってきた。この理由は、(1)アミノアシルtRNAの分解が速いため(導入操作中に、または、導入操作でダメージを受けた細胞が活発な蛋白質合成を再開するまでに、分解してしまうため)か、(2)細胞内の翻訳システムにフリーのアミノアシルtRNAが入り込むのが難しいためだと考えている。現在、(1)に対しては、アミノアシルtRNAの化学的保護および蛋白質による保護、(2)に対しては、アミノアシルtRNAと翻訳因子eEF1Aの複合体を細胞内導入すること、などの対策を行っているところである。2) 人工細胞内で非天然アミノ酸を含む蛋白質を合成するシステムの開発:人工モデル細胞(リポソーム)中に無細胞蛋白質合成系を内包して、人工細胞内で蛋白質合成を行うようなシステムが報告されている。このシステムに、4塩基コドンを持つmRNAと非天然アミノ酸を担持したアミノアシルtRNAを加え、4塩基コドンで指定した部位に非天然アミノ酸を含む蛋白質の合成が可能であることを示した。このシステムで膜蛋白質ロドプシンに蛍光性非天然アミノ酸を導入することに成功し、これが膜に局在することも分かってきた。

该对象是构建一个包含扩展的蛋白质合成系统的细胞系统（将非天然氨基酸引入蛋白质的系统），并构建包含扩展的蛋白质合成系统的人工细胞系统。今年，我们对以下各种研究进行了研究：1）开发用于细胞中含有非天然氨基酸的蛋白质的系统：为了使细胞中含有非天然氨基酸的蛋白质合成，我们研究了氨基酰基TRNA的细胞内引入（在这里，TRNA携带非自然氨基酸的TRNA）。尽管氨基酰基tRNA可以通过脂外观，显微注射和电穿孔引入细胞，但已经发现它仅以极低的效率用于细胞内蛋白质的合成。原因是（1）是因为氨基酰基tRNA迅速降解（由于引入过程损坏的细胞迅速降解，或在引入过程中损坏的时间单元恢复过程恢复活动蛋白合成的时间单元格），或（2），因为对于waryacyly trna而言，很难在单元格中输入转换系统。目前，正在采取措施，例如（1）的氨基酰基tRNA和蛋白质保护的化学保护，以及诸如（2）的细胞内引入氨基酰基tRNA复合物和翻译因子EEF1A。 2）开发用于人造细胞中含有非天然氨基酸的蛋白质的系统：已经报道了一个系统，其中无细胞的蛋白质合成系统封装在人工模型细胞（脂质体）中，并在人工细胞内进行蛋白质合成。将该系统添加到mRNA中，其中有4个基本密码子和带有非天然氨基酸的氨基酰基tRNA，表明可以在由4个基本密码子指定的位点合成含有不自然氨基酸的蛋白质。该系统已成功将荧光非天然氨基酸引入膜蛋白视紫红质，还发现它位于膜上。