RNAi創薬を目指したRNAデリバリー技術の開発

开发RNA递送技术以发现RNAi药物

• 批准号: 20015032
• 负责人: 大槻 高史
• 金额: $ 5.5万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20015032/
• 关键词: shRNA; siRNA; RNAi; RNAキャリア; TatU1A; RNAデリバリー; 乳酸菌; RNA結合蛋白質; 光刺激; CLIP-RNAi; キャリアペプチド

最近、研究代表者らは、細胞内侵入性ペプチド(CPP)融合型RNA結合蛋白質(RBP)と、そのRBPの認識RNA配列につながったsiRNAを組み合わせて細胞内に導入する方法を開発した。昨年度からの本助成研究において手法の確立が進んだが、本年度はがん治療への応用を目指して、CPP-RBPによるRNA導入法に関して以下の検討を行った。1) CPP-RBPでsiRNAを細胞内導入することにより、ヒトの大腸癌細胞由来株であるSW480株の増殖抑制が可能かどうかを検討した。大腸癌細胞由来株で特異的に発現しているK-Ras変異体遺伝子のRNAi法による発現抑制により、その増殖抑制を試みたが現状では顕著な増殖抑制効果は見られていない。今後のCPP-RBPの改良により明確な効果が現れることを期待している。2) 腸内の癌の治療を目指し、乳酸菌にCPP-RBP/shRNAを合成させて腸内送達する方法の開発を目指す。現状ではshRNAのみを産生する乳酸菌株を作製し、マウスにおいてこの乳酸菌を投与することで特異的なRNAi効果が起こることを見いだした。今後CPP-RBPとshRNAの共発現系を内包する乳酸菌を作ることにより、このRNAi効果がより顕著になることを期待している。3) 癌細胞で過剰発現がみられる膜蛋白質を標的とした抗体あるいはペプチドを、CPP-RBPに融合させることにより、CPP-RBP/shRNA複合体が癌細胞にのみ結合しやすくなり、それに伴いshRNAの細胞内導入効率RNAi効果が高まらないかと考えた。本年度はその例として卵巣癌や乳癌などで過剰発現がみられるErbB2に結合する蛋白質をCPP-RBPに融合させたものを作製した。現在、これにより通常のCPP-RBPと比べて癌細胞の増殖抑制効果が高まるかどうかを調べている。

最近，研究人员开发了一种方法，将细胞穿透肽 (CPP) 融合的 RNA 结合蛋白 (RBP) 和连接到 RBP 识别 RNA 序列的 siRNA 组合引入细胞中。去年以来，通过这项资助研究，该方法的建立取得了进展，但今年，为了将其应用于癌症治疗，我们对使用CPP-RBP的RNA导入方法进行了以下研究。 1) 我们研究了是否可以通过在细胞内导入带有CPP-RBP的siRNA来抑制源自人结肠癌细胞的SW480株的生长。我们尝试使用RNAi抑制结肠癌细胞系中特异表达的K-Ras突变基因的增殖，但迄今为止尚未观察到明显的生长抑制作用。我们希望未来对CPP-RBP的改进能够产生明显的效果。 2）为了治疗肠道癌症，我们的目标是开发一种让乳酸菌合成CPP-RBP/shRNA并将其输送到肠道的方法。我们创建了一种目前仅产生shRNA的乳酸菌菌株，并发现给小鼠施用这种乳酸菌会产生特定的RNAi效果。我们希望通过创建含有 CPP-RBP 和 shRNA 共表达系统的乳酸菌，这种 RNAi 效应将变得更加明显。 3) 通过将 CPP-RBP 与靶向癌细胞中过度表达的膜蛋白的抗体或肽融合，CPP-RBP/shRNA 复合物变得更有可能只与癌细胞结合，结果 shRNA 我们认为可以提高RNAi引入细胞的效率。例如，今年，我们创建了一种与 ErbB2（在卵巢癌和乳腺癌中过度表达）结合的蛋白质，并将其与 CPP-RBP 融合。我们目前正在研究这是否比常规 CPP-RBP 对癌细胞生长具有更大的抑制作用。

项目成果

CLIP-RNAi法による光照射領域特異的な遺伝子発現抑制

使用 CLIP-RNAi 方法抑制光照射区域特异性基因表达

• 发表时间: 2009
• 作者: Endoh;T.;Sisido M. and Ohtsuki;T.;山原裕輔;Ryo Shintani;佐藤麻恵;桑原里奈;片山和浩;新谷諒;三戸沙耶香;大槻高史
• 通讯作者: 大槻高史

The central dogma : from DNA to RNA, and to protein. In "Automation in Proteomics and Genomics"

中心法则：从DNA到RNA，再到蛋白质。

• 发表时间: 2009
• 作者: Ohtsuki;T.
• 通讯作者: T.

EF-Tu変異体によるアミノアシルtRNAの精製・定量法

使用 EF-Tu 突变体纯化和定量氨酰基-tRNA

• 发表时间: 2008
• 作者: 山本浩道;土井芳朗;大槻高史;宍戸昌彦
• 通讯作者: 宍戸昌彦

Carrier PNA for shRNA delivery into cells.

用于将 shRNA 递送到细胞中的载体 PNA。

• 发表时间: 2009
• 期刊: Bioorg.Med.Chem.Lett. 19
• 作者: Mizuki Kitamatsu;Takanori Kubo;Rino Matsuzaki;Tamaki Endoh;Takashi Ohtsuki;Masahiko Sisido.
• 通讯作者: Masahiko Sisido.

哺乳細胞を用いた非天然アミノ酸導入蛋白質合成法の開発

开发利用哺乳动物细胞的非天然氨基酸合成蛋白质的方法

• 发表时间: 2008
• 作者: 土井芳朗;大槻高史;宍戸昌彦
• 通讯作者: 宍戸昌彦