生細胞中での蛋白質の部位特異的蛍光標識法の開発

活细胞蛋白质位点特异性荧光标记方法的开发

基本信息

批准号：
17750162
负责人：
大槻高史
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞内の生体分子の動態や局在などのネットワークを調べることはポストゲノム時代の最重要課題の1つである。この課題を網羅的・効率的に進めるためには、生体分子を可視化させる蛍光標識技術の開発が必要である。蛋白質分子の蛍光標識法としては、目的蛋白質の末端にGFPなど蛍光蛋白質を結合させる方法が現在一般的であるが、大きな蛍光蛋白質を融合することにより目的蛋白質の本来の性質が損なわれる可能性も高い。そこで、蛋白質の機能に極力影響を与えない小さな蛍光基の導入が望まれる。本課題では、細胞内で蛋白質中の望んだ部位に蛍光基を導入する方法を開発することを試みた。本方法は細胞内の蛋白質合成装置を利用し、蛍光基をもつアミノ酸を直交化tRNAに結合させ、mRNA上のコドン特異的に蛋白質に導入するというものである。この方法では、蛍光部位は小さな蛍光基としてアミノ酸一残基分のスペースに導入するため、蛋白質の機能を損なう可能性は少ない。本年度は、細胞内翻訳装置により蛍光アミノ酸を蛋白質に組み込む方法を検討した。蛍光アミノ酸に対応するコドンとしてアンバーコドンを用い、アンバーコドンを含む蛋白質遺伝子(ここではDsRed遺伝子)を発現ベクターに組み込んで、哺乳動物細胞(ここではCHO細胞)に導入した。その細胞に細胞内のARSによりアミノアシル化されるようなサプレッサーtRNAをリポフェクション法により導入したところ、DsRedの赤色蛍光によりアンバーコドンのサプレッションが観測された。細胞外で蛍光アミノ酸(Bodipy-FL-AF)を結合させたサプレッサーtRNAを用いた場合も、アミノアシルtRNAのエンドソーム経由での細胞内導入が確認された。主にエンドソーム内にアミノアシルtRNAが固まって強い蛍光を放っていたため、これを改善するような導入法を今後さらに検討する。

研究网络等网络在细胞中的动力学和定位是后基因组时代最重要的问题之一。为了完成此问题，有必要开发可视化生物分子的荧光标签技术。作为蛋白质分子荧光标记的一种方法，目前常见的是结合荧光蛋白（例如GFP）与靶蛋白结束的荧光蛋白的方法，但是靶蛋白的原始特性很可能会因大型荧光蛋白的融合而受到损害。因此，希望引入不影响蛋白质功能的小荧光基团。在这个主题中，我们试图开发一种将荧光基团引入细胞内蛋白质所需位点的方法。该方法利用细胞内蛋白质合成装置与荧光基团结合氨基酸与正交tRNA结合，并将其专门在mRNA上引入蛋白质。在这种方法中，将荧光位点作为一个小荧光组引入到一个氨基酸残基的空间中，因此蛋白质的功能很少会受到损害。今年，我们研究了一种使用细胞内翻译装置将荧光氨基酸掺入蛋白质中的方法。将琥珀色密码子用作对应于荧光氨基酸的密码子，并将含有琥珀色密码子的蛋白基因（在此，dsred基因）掺入表达载体中，并引入了哺乳动物细胞中（这里，Cho细胞）。当通过LiPofection将细胞内ARS氨基酰基的抑制tRNA引入细胞中时，由于DSRED的红色荧光，观察到了琥珀色密码子的抑制。当使用含有荧光氨基酸的抑制tRNA（BODIPY-FL-AF）时，通过内体的细胞内引入氨基酰基tRNA。由于氨基酰基TRNA主要在内体内固化并发出强烈的荧光，因此将来将研究进一步的介绍方法以改善这种方法。