生細胞中での蛋白質の部位特異的蛍光標識法の開発

活细胞蛋白质位点特异性荧光标记方法的开发

基本信息

批准号：
17750162
负责人：
大槻高史
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞内の生体分子の動態や局在などのネットワークを調べることはポストゲノム時代の最重要課題の1つである。この課題を網羅的・効率的に進めるためには、生体分子を可視化させる蛍光標識技術の開発が必要である。蛋白質分子の蛍光標識法としては、目的蛋白質の末端にGFPなど蛍光蛋白質を結合させる方法が現在一般的であるが、大きな蛍光蛋白質を融合することにより目的蛋白質の本来の性質が損なわれる可能性も高い。そこで、蛋白質の機能に極力影響を与えない小さな蛍光基の導入が望まれる。本課題では、細胞内で蛋白質中の望んだ部位に蛍光基を導入する方法を開発することを試みた。本方法は細胞内の蛋白質合成装置を利用し、蛍光基をもつアミノ酸を直交化tRNAに結合させ、mRNA上のコドン特異的に蛋白質に導入するというものである。この方法では、蛍光部位は小さな蛍光基としてアミノ酸一残基分のスペースに導入するため、蛋白質の機能を損なう可能性は少ない。本年度は、細胞内翻訳装置により蛍光アミノ酸を蛋白質に組み込む方法を検討した。蛍光アミノ酸に対応するコドンとしてアンバーコドンを用い、アンバーコドンを含む蛋白質遺伝子(ここではDsRed遺伝子)を発現ベクターに組み込んで、哺乳動物細胞(ここではCHO細胞)に導入した。その細胞に細胞内のARSによりアミノアシル化されるようなサプレッサーtRNAをリポフェクション法により導入したところ、DsRedの赤色蛍光によりアンバーコドンのサプレッションが観測された。細胞外で蛍光アミノ酸(Bodipy-FL-AF)を結合させたサプレッサーtRNAを用いた場合も、アミノアシルtRNAのエンドソーム経由での細胞内導入が確認された。主にエンドソーム内にアミノアシルtRNAが固まって強い蛍光を放っていたため、これを改善するような導入法を今後さらに検討する。

检查细胞中生物分子的动力学和本地化等网络是基因组时代最重要的问题之一。为了全面有效地解决此问题，有必要开发一种可视化生物分子的荧光标签技术。作为蛋白质分子的荧光标记方法，将荧光蛋白（例如GFP）结合到目的蛋白的结束通常是常见的，但是可能会通过融合大型荧光蛋白来损害目的蛋白的原始性质。昂贵的。因此，希望引入一个不会尽可能多地影响蛋白质功能的小荧光基团。在此任务中，我们试图开发一种在细胞中蛋白质中所需部分中引入荧光组的方法。该方法是在细胞中使用蛋白质合成器械，将氨基酸与荧光基团结合到Orthogona，并专门在mRNA上专门在密码子上引入蛋白质。在这种方法中，将荧光位点引入剩余氨基酸空间中的一个小荧光基团，因此蛋白质的功能不太可能受到损害。今年，我们检查了一种通过细胞内翻译装置将荧光氨基酸掺入蛋白质中的方法。将琥珀色密码子作为对应于荧光氨基酸的密码子，将含有琥珀色密码子（此处，dsred基因）的蛋白质基因掺入表达载体中，并引入哺乳动物细胞（此处，这里为CHO细胞）。通过DSRED的红色荧光引入了氨基的引入氨基tRNA，该释放的tRNA被氨基含量，并观察到了琥珀色补充剂。如果Supressio tRNA结合了细胞外荧光氨基酸（Bodipy-Fl-AF），则通过末端确认了氨基酸tRNA的细胞内引入。由于氨基SIL TRNA（主要是最终）被固化并发出强荧光，因此我们将研究将来的引入方法来改善这种情况。