非天然アミノ酸含有タンパク質の無細胞及び細胞モデル系での発現

含有非天然氨基酸的蛋白质在无细胞和细胞模型系统中的表达

基本信息

批准号：
18048031
负责人：
大槻高史
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

生命機能の再構成という目において、蛋白質生合成系の役割は大きい。本研究では、蛋白質へ非天然アミノ酸を導入する技術の開発を通じて、蛋白質合成の分子基盤の理解と、人工的な細胞機能の再構築を目指す。具体的には、非天然アミノ酸含有蛋白質合成系をtRNAや翻訳因子の改良により更に効率化し、無細胞系及びモデル細胞系で利用することを目的とする。本年度は、以下の項目に取り組んだ。(1)改良した合成システムによる新規な人工蛋白質の創製前年度に改変を行ったEF-Tu、及び、開発した4塩基コドン用tRNAにより、以下の(i).(ii)を試みた。(i)従来取り込み効率の低かった非天然アミノ酸の蛋白質への導入:改変EF-Tuを用いることによりこれまでほとんど蛋白質へ導入できなかった1-pyrenylalanineの導入が可能になったという結果を前年度に得ている。このような例を更に数例調べ、導入効率の極めて低かった2-anthraquinonylalanineおよび1-pyrenylalanineの効率的な導入が可能になったことを明らかにした。これらの結果および前年度の結果は本年度11月にJ.Am. Chem.Soc誌に掲載された。(ii)蛋白質への複数種の非天然アミノ酸の同時導入:4塩基コドン用に開発した高性能なtRNAを用いて1つの蛋白質に複数種の非天然アミノ酸の同時導入を試みた。その結果、3種類の非天然アミノ酸の同時導入が可能になった。(2)細胞中での非天然アミノ酸含有蛋白質発現上の高効率非天然蛋白質発現系を細胞内に導入し、その中で蛍光ラベル蛋白質を合成させることを目指した。細胞としては哺乳動物細胞を用いた。現在のところ、細胞内への蛍光アミノアシルtRNAの導入法の開発途上であり、わずかながら導入できることが認められた。今後さらに導入法を最適化し、蛍光アミノアシル化tRNAが細胞内翻訳系で用いられて蛍光ラベル蛋白質の産生に結びつくことを確認したい。

蛋白质生物合成系统在生命功能的重组中发挥着重要作用。在这项研究中，我们的目标是通过开发将非天然氨基酸引入蛋白质的技术来了解蛋白质合成的分子基础并人工重建细胞功能。具体来说，目的是通过改进tRNA和翻译因子，进一步提高含非天然氨基酸的蛋白质合成系统的效率，并将其应用于无细胞系统和模型细胞系统中。今年，我们做了以下几方面的工作。 (1)使用改进的合成系统创建新的人工蛋白质我们使用去年修改的EF-Tu和我们开发的四碱基密码子的tRNA尝试了以下(i)和(ii)。 (i) 将非天然氨基酸引入到以前掺入效率较低的蛋白质中：去年，我们报道了通过使用修饰的 EF-Tu，可以将迄今为止很难引入到蛋白质中的 1-芘基丙氨酸引入。正在得到它。我们进一步研究了几个这样的案例，并明确了可以有效地引入引入效率极低的2-蒽醌丙氨酸和1-芘基丙氨酸。这些结果和去年的结果于今年 11 月发表在 J.Am.Chem.Soc 上。 (ii)同时将多种类型的非天然氨基酸引入到蛋白质中：我们尝试使用针对4碱基密码子开发的高性能tRNA将多种类型的非天然氨基酸同时引入到单一蛋白质中。结果，可以同时引入三种类型的非天然氨基酸。 (2)我们的目的是在细胞中引入高效的非天然蛋白质表达系统来表达含有非天然氨基酸的蛋白质，并在其中合成荧光标记的蛋白质。使用哺乳动物细胞作为细胞。目前，我们正在开发一种将荧光氨酰-tRNA导入细胞的方法，并已证实可以小范围导入。未来，我们希望进一步优化引入方法，并确认荧光氨酰化tRNA用于细胞内翻译系统并导致荧光标记蛋白的产生。