酵母カルパインホモログCpl1の活性制御機構の解析

酵母钙蛋白酶同源物Cpl1活性调控机制分析

基本信息

批准号：
19044012
负责人：
前田達哉
金额：
$ 4.1万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に見出した、アルカリ刺激に応答してSnf7の局在が細胞質からエンドソームへと移行する現象を、蛍光免疫染色法を用いた顕微鏡観察で確認した。また、この移行が、Rim101経路上流のセンサー部構成因子の欠損変異株とエンドソーム・ソーティングを担うESCRT複合体構成因子の欠損変異株でも見られるかどうかを検討した。その結果、この移行はセンサー部には依存せず、ESCRT複合体機能に依存することが明らかになった。このことと一致して、アルカリ刺激によりエンドソーム・ソーティングが実際に一過的に阻害されることを、細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターの液胞への輸送を指標に確認した。これらの結果から、アルカリ刺激に応答したエンドソーム膜上における活性プロテアーゼ複合体の形成には、ESCRT複合体のターンオーバーの遅滞によるSnf7のエンドソーム膜上への貯留と、センサー部に依存したこれとは別の活性化ステップとが寄与していることが明らかになった。Rim101の切断で生じるC末端側断片のN末端は、何らかの修飾によりブロックされていてエドマン法による配列決定が困難であった。配列決定の困難を克服するため、Rim101のC末端に付加する精製用のタグを工夫し、さらに大量培養を採用することで、より精製度の高い切断産物を大量に調製する方法を確立した。しかしながら、十分量の標品を用いてもN末端配列を決定することはできず、修飾は切断後すみやかに起こる現象であることが示唆された。また、調製した切断産物をトリプシン消化して生じたペプチドを質量分析機によって解析したが、N末端に由来すると考えられる新規ペプチドは同定できなかった。

我们通过使用荧光免疫染色的显微镜观察证实了前一年发现的现象，即Snf7的定位响应碱性刺激从细胞质转移到核内体。我们还检查了在缺乏 Rim101 通路上游传感器组件的突变体和缺乏负责内体分选的 ESCRT 复合体组件的突变体中是否观察到这种转变。结果表明，这种转变并不取决于传感器区域，而是取决于 ESRT 复合体的功能。与此相一致的是，我们以细胞膜中的氨基酸转运蛋白向液泡的转运作为指标，证实碱刺激实际上暂时抑制了内体分选。这些结果表明，在内体膜上响应碱性刺激而形成的活性蛋白酶复合物涉及由于ESCRT复合物的延迟周转而在内体膜上保留Snf7，并且清楚的是另一种激活机制。一步做出了贡献。 Rim101切割产生的C端片段的N端被一些修饰封闭，使得通过Edman方法对其进行测序变得困难。为了克服测序的困难，我们设计了一个附着在Rim101 C末端的纯化标签，并建立了通过大规模培养制备大量高纯度裂解产物的方法。然而，即使使用足够量的制剂也无法确定 N 末端序列，这表明修饰在切割后立即发生。另外，使用质谱仪对制备的裂解产物进行胰蛋白酶消化而产生的肽进行分析，但没有鉴定出被认为源自N末端的新肽。