膜蛋白質に対する相互作用を検出できる新しいtwo-hybrid法の開発

开发一种新的双杂交方法，可以检测与膜蛋白的相互作用

基本信息

批准号：
13878140
负责人：
前田達哉
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878140/
关键词：
two-hybrid法膜蛋白質酵母クローニング

项目摘要

酵母two-hybrid法は、生化学的方法に代わる簡便かつ強力な蛋白質間相互作用の検出方法として広く用いられているが、膜蛋白質の場合には本来の構造を維持したまま核内で発現させることが不可能であるため、構造に依存した相互作用は検出することができない。本研究は、原法の転写因子の再構成に代わって、酵母の接合因子情報伝達経路を利用することにより、この問題点を克服した新しいtwo-hybrid法の開発を目指した。酵母の接合因子情報伝達経路は、接合因子に応答してMAPキナーゼカスケードが活性化される。これは受容体の活性化に伴いG蛋白質αサブユニットから解離したβ/γサブユニットが、足場(scaffold)蛋白質Ste5との結合を介してキナーゼ複合体を細胞膜にリクルートすることによって起こる、したがって膜蛋白質XとSte5-蛋白質Y融合蛋白質とを酵母内で発現すると、XとYが相互作用する場合に限りSte5が人工的に細胞膜へとリクルートされて経路が活性化されることになる。経路の活性化に応答するレポーター遺伝子(FUS1)を組み込んだ酵母を宿主に用いることにより、膜蛋白質X-蛋白質Y間の相互作用をレポーター遺伝子の発現として検出することができる。必要とされる種々の遺伝的改変を加えた宿主株を構築した。Ste5融合蛋白質発現用ベクターとして、Ste5の発現プラスミドの終止コドンを欠失させて代わりにマルチクローニングサイトを導入したものを構築した。コントロール実験として、膜蛋白質Sholに結合することが知られている配列をSte5融合蛋白質発現用ベクターに挿入し、この宿主株に導入したところ、レポーター遺伝子の発現が陽性になることが確認され、系の実効性が確認された。

酵母双杂交方法被广泛用作一种检测生物化学方法之间简单而强大的相互作用的方法，但是在膜蛋白的情况下，它在核中表达，同时保持原始结构。相互作用取决于无法检测到的结构。这项研究旨在开发一种新的两杂交方法，该方法通过使用酵母的联合因子信息传输途径来克服此问题，而不是重新构造原始定律的转移因子。在酵母的联合因子信息传输途径中，通过响应连接因子来激活MAP激酶级联反应。这是一种薄膜，其中已从G蛋白α亚基与受体的激活分离的β/γ亚基是通过与脚手架蛋白X的键合成的，将激酶复合物募集到细胞膜中。 Ste5-蛋白Y融合蛋白在酵母中表达，仅当X和Y相互作用时，Ste5才会人为地募集到细胞膜，并且该路线被激活。通过使用含有记者基因（FUS1）的酵母，该基因对路线的激活有反应，可以将膜蛋白X蛋白质Y之间的相互作用视为报告基因的表达。我们已经建立了一个具有各种遗传修饰的洛克股票。作为Ste5融合蛋白表达的矢量，安装了多个克隆位点，而不是Ste5表达质粒末端的末端。作为对照实验，将已知与膜蛋白shol结合的序列插入融合蛋白表达的载体中，并引入该宿主储备，并证实了报告基因的表达是阳性的。