活性化型TOR変異体を用いた代謝活性化による組換えタンパク質生産能の向上

使用激活的 TOR 突变体通过代谢激活提高重组蛋白生产能力

基本信息

  • 批准号:
    20658027
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.3万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
  • 财政年份:
    2008
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2008 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

酵母発現系では、TORC1に対する寄与の大きいTOR1遺伝子に活性化型変異を導入した株を用いた。哺乳類S6キナーゼの酵母ホモログであるSch9のリン酸化がこの株で昂進していることを確認した。強力なGPDプロモーターによりモデルタンパク質β-ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを野生株と活性化型TOR1変異株に導入し、酵素活性を指標に発現量を検討した。バッチ法で培養を続け、対数増殖期、対数増殖後期、定常期における発現量を定量したところ、いずれの条件においても総タンパク質量あたりの発現量に有意な差を認めなかった。一方、菌数あたりの総タンパク質量は、活性化型TOR1変異株の方が一貫して1割程度多かった。このことから、活性化型TOR1変異株を用いることで菌数あたりのタンパク質発現量が改善されることが明らかになった。哺乳類培養細胞発現系では、最も活性の高かったmTOR SL1+IT変異体を用いた。HEK293細胞に野生型mTOR発現プラスミドもしくはmTOR SLI+IT発現プラスミドとルシフェラーゼ発現プラスミドとを同時に導入し、薬剤耐性を利用してプラスミド導入細胞を選択した後、細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性を指標に発現量を評価したが、有意な差が認められなかった。また、翻訳困難なmRNAのモデルとして、5'非翻訳領域にステムループ構造を挿入したルシフェラーゼ発現プラスミドからの発現量を検討したが、有意な差が認められなかった。さらに、HeLa細胞を用いて野生型mTORもしくはmTORSL1+ITの安定発現株を作製し、同様な解析を行ったが有意な差が認められなかった。これらの結果から、十分な血清を含んだDMEM培地においては、mTORSLI+ITを導入しても組換えタンパク質産生を改善することは困難であることが明らかになった。
在酵母表达系统中,我们使用了在TOR1基因中引入了激活突变的菌株,该突变对TORC1有很大的贡献。我们证实,哺乳动物 S6 激酶的酵母同源物 Sch9 的磷酸化在该菌株中得到增强。将表达由强GPD启动子驱动的模型蛋白β-半乳糖苷酶的质粒导入野生型菌株和激活的TOR1突变菌株中,并以酶活性为指标检查表达水平。当以分批法继续培养并对对数生长期、对数生长期后期和稳定期的表达水平进行定量时,在任何条件下均未观察到单位总蛋白量的表达水平的显着差异。另一方面,在激活的 TOR1 突变菌株中,每单位细菌的总蛋白量始终高出约 10%。这些结果表明,使用激活的 TOR1 突变菌株提高了单位数量细菌的蛋白质表达水平。在哺乳动物培养细胞表达系统中,我们使用了mTOR SL1+IT突变体,其活性最高。将野生型mTOR表达质粒或mTOR SLI+IT表达质粒和荧光素酶表达质粒同时导入HEK293细胞中,利用耐药性选择导入质粒的细胞,并以细胞提取物中的荧光素酶活性为指标测定表达水平进行了评估,但没有观察到显着差异。此外,作为难以翻译的mRNA的模型,我们检查了在5'非翻译区插入茎环结构的荧光素酶表达质粒的表达水平,但没有观察到显着差异。此外,我们使用 HeLa 细胞生成了稳定表达野生型 mTOR 或 mTORSL1+IT 的细胞系,并进行了类似的分析,但没有观察到显着差异。这些结果表明,即使将mTORSLI+IT引入到含有足够血清的DMEM培养基中,也难以提高重组蛋白的产量。

项目成果

期刊论文数量(3)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
浸透圧刺激直後におけるMAPキナーゼ経路間特異性維持機構
渗透刺激后立即维持 MAP 激酶通路特异性的机制
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠;高原照直;前田達哉;前田達哉;前田達哉
  • 通讯作者:
    前田達哉
Isolation of Hyperactive Mutants of Mammalian Target of Rapamycin
  • DOI:
    10.1074/jbc.m801546200
  • 发表时间:
    2008-11-14
  • 期刊:
  • 影响因子:
    4.8
  • 作者:
    Ohne, Yoichiro;Takahara, Terunao;Maeda, Tatsuya
  • 通讯作者:
    Maeda, Tatsuya
活性亢進型TORを用いた酵母TOR経路制御因子の探索
使用高活性 TOR 寻找酵母 TOR 通路调节因子
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠;高原照直
  • 通讯作者:
    高原照直
Delayed activation kinetics ensures the signalling specificity of the hy perosmotic stress-responsive MAP kinase pathway in yeast
延迟激活动力学确保酵母中高渗应激反应 MAP 激酶途径的信号传导特异性
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠;高原照直;前田達哉;前田達哉
  • 通讯作者:
    前田達哉
アルカリストレス応答性Rimlol経路をRim9-Rim8とDfg16-Rim8融合タンパク質は活性化できる
Rim9-Rim8 和 Dfg16-Rim8 融合蛋白可激活碱性应激反应 Rimlol 通路
  • DOI:
  • 发表时间:
    2009
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠
  • 通讯作者:
    篠崎翠
{{ item.title }}
{{ item.translation_title }}
  • DOI:
    {{ item.doi }}
  • 发表时间:
    {{ item.publish_year }}
  • 期刊:
  • 影响因子:
    {{ item.factor }}
  • 作者:
    {{ item.authors }}
  • 通讯作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ journalArticles.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ monograph.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ sciAawards.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ conferencePapers.updateTime }}

{{ item.title }}
  • 作者:
    {{ item.author }}

数据更新时间:{{ patent.updateTime }}

前田 達哉其他文献

骨格筋特異的なカルパインp94の遺伝子改変セゥスは筋ジストロフィー様の症状を呈する
骨骼肌特异性钙蛋白酶 p94 基因修饰的 S. ceusus 表现出肌营养不良症样症状。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    尾嶋 孝一;川畑 順子;中尾 晴美;小野 弥子 土井 奈穂子;北村ふじ子;秦勝志. 川原 裕之;Christian Witt;Siegfride Labeit;鈴木 紘一;阿部 啓子;前田 達哉;饗 場篤;反町 洋之
  • 通讯作者:
    反町 洋之
Pib2 is a glutamine sensor that directly activates TORC                           that directly activates TORC1
Pib2是直接激活TORC的谷氨酰胺传感器
  • DOI:
  • 发表时间:
    2021
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    谷川美頼 ;山本 勝良 ;長門石 曉 ;津本 浩平;能代 大輔 ; 野田 展生;永田 宏次 ;前田 達哉
  • 通讯作者:
    前田 達哉
生体情報応答性カルシウム結合蛋白質およびその相互作用因子に関する構造と機能
生物信息响应钙结合蛋白的结构和功能及其相互作用因子
  • DOI:
  • 发表时间:
    2019
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    渡辺 大輔;杉本 幸子;水野 恵;周 延;陳 佳文;赤尾 健;下飯 仁;前田 達哉;高木 博史;牧 正敏
  • 通讯作者:
    牧 正敏
Pib2 is a glutamine sensor that directly activates TORC1
Pib2 是直接激活 TORC1 的谷氨酰胺传感器
  • DOI:
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    谷川美頼 ;山本 勝良 ;長門石 曉 ;津本 浩平;能代 大輔 ; 野田 展生;永田 宏次 ;前田 達哉
  • 通讯作者:
    前田 達哉
酵母のグルタミン特異的 TORC1活性化機構
酵母中谷氨酰胺特异性 TORC1 激活机制
  • DOI:
  • 发表时间:
    2018
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    谷川 美頼;山本 勝良;前田 達哉
  • 通讯作者:
    前田 達哉

前田 達哉的其他文献

{{ item.title }}
{{ item.translation_title }}
  • DOI:
    {{ item.doi }}
  • 发表时间:
    {{ item.publish_year }}
  • 期刊:
  • 影响因子:
    {{ item.factor }}
  • 作者:
    {{ item.authors }}
  • 通讯作者:
    {{ item.author }}

{{ truncateString('前田 達哉', 18)}}的其他基金

医療スタッフの労働環境の改善を目的とした柔軟性を併せ持つX線遮蔽体の開発
开发灵活的X射线防护罩以改善医务人员的工作环境
  • 批准号:
    23KJ1028
  • 财政年份:
    2023
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
酵母カルパインホモログCpl1の活性制御機構の解析
酵母钙蛋白酶同源物Cpl1活性调控机制分析
  • 批准号:
    19044012
  • 财政年份:
    2007
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
真核生物型低温ストレス検知機構の解析
真核生物冷应激检测机制分析
  • 批准号:
    15657032
  • 财政年份:
    2003
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
膜蛋白質に対する相互作用を検出できる新しいtwo-hybrid法の開発
开发一种新的双杂交方法,可以检测与膜蛋白的相互作用
  • 批准号:
    13878140
  • 财政年份:
    2001
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
モデル生物を用いた癌抑制遺伝子産物PTENの機能解析
使用模型生物体对抑癌基因产物 PTEN 进行功能分析
  • 批准号:
    12213037
  • 财政年份:
    2000
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)

相似海外基金

Dimerization-induced signal generation of GPCR: Single molecule observation in live cells
GPCR 二聚化诱导的信号生成:活细胞中的单分子观察
  • 批准号:
    17K07333
  • 财政年份:
    2017
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Development and applications of yeast-based biosensor for high efficient production of valuable products
基于酵母的生物传感器的开发和应用,用于高效生产有价值的产品
  • 批准号:
    17K17878
  • 财政年份:
    2017
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Physico-chemical and mathematical analyses of immune related signal induced by antibody aggregates
抗体聚集体诱导的免疫相关信号的物理化学和数学分析
  • 批准号:
    17H03975
  • 财政年份:
    2017
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Studies on the signal transduction mechanisms regulated by heterodimer formation of GPCR
GPCR异二聚体形成调控信号转导机制的研究
  • 批准号:
    26870292
  • 财政年份:
    2014
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Application of Multi-PK antibody that detects a wide variety of protein kinases
检测多种蛋白激酶的Multi-PK抗体的应用
  • 批准号:
    21510226
  • 财政年份:
    2009
  • 资助金额:
    $ 2.3万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
{{ showInfoDetail.title }}

作者:{{ showInfoDetail.author }}

知道了