活性化型TOR変異体を用いた代謝活性化による組換えタンパク質生産能の向上

使用激活的 TOR 突变体通过代谢激活提高重组蛋白生产能力

• 批准号: 20658027
• 负责人: 前田 達哉
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20658027/
• 关键词: 蛋白質; バイオテクノロジー; シグナル伝達; 微生物; 細胞・組織

酵母発現系では、TORC1に対する寄与の大きいTOR1遺伝子に活性化型変異を導入した株を用いた。哺乳類S6キナーゼの酵母ホモログであるSch9のリン酸化がこの株で昂進していることを確認した。強力なGPDプロモーターによりモデルタンパク質β-ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを野生株と活性化型TOR1変異株に導入し、酵素活性を指標に発現量を検討した。バッチ法で培養を続け、対数増殖期、対数増殖後期、定常期における発現量を定量したところ、いずれの条件においても総タンパク質量あたりの発現量に有意な差を認めなかった。一方、菌数あたりの総タンパク質量は、活性化型TOR1変異株の方が一貫して1割程度多かった。このことから、活性化型TOR1変異株を用いることで菌数あたりのタンパク質発現量が改善されることが明らかになった。哺乳類培養細胞発現系では、最も活性の高かったmTOR SL1+IT変異体を用いた。HEK293細胞に野生型mTOR発現プラスミドもしくはmTOR SLI+IT発現プラスミドとルシフェラーゼ発現プラスミドとを同時に導入し、薬剤耐性を利用してプラスミド導入細胞を選択した後、細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性を指標に発現量を評価したが、有意な差が認められなかった。また、翻訳困難なmRNAのモデルとして、5'非翻訳領域にステムループ構造を挿入したルシフェラーゼ発現プラスミドからの発現量を検討したが、有意な差が認められなかった。さらに、HeLa細胞を用いて野生型mTORもしくはmTORSL1+ITの安定発現株を作製し、同様な解析を行ったが有意な差が認められなかった。これらの結果から、十分な血清を含んだDMEM培地においては、mTORSLI+ITを導入しても組換えタンパク質産生を改善することは困難であることが明らかになった。

在酵母表达系统中，使用了一个菌株，其中使用了激活的突变引入TOR1基因的菌株，该菌株使用了有助于TORC1的菌株。已经证实，在该菌株中，Sch9的磷酸化是哺乳动物S6激酶的酵母同源物。将使用强GPD启动子表达模型蛋白β-半乳糖苷酶的质粒被引入野生应变中并激活的TOR1突变菌株，并使用酶活性作为指标检查了表达水平。继续使用批处理方法进行培养，并在对数，对数晚期和固定相的过程中对表达水平进行了量化，并且在任何条件下，每个总蛋白质量的表达水平在表达水平均未发现显着差异。另一方面，对于活化的TOR1突变体而言，每种细菌计数的总蛋白质含量始终高约10％。这表明使用活化的TOR1突变菌株可改善每个细菌计数的蛋白质表达量。最活跃的MTOR SL1+IT突变体用于哺乳动物培养的细胞表达系统。同时引入野生型MTOR表达质粒或MTOR SLI+IT表达质粒，荧光素酶表达质粒同时引入HEK293细胞中，并且在使用耐药性选择质粒引入的细胞后，在细胞中使用荧光素酶活性评估了表达水平，但在细胞提取物中使用荧光素酶活性评估，但没有观察到显着差异。此外，作为难以翻译mRNA的模型，研究了荧光素酶表达质粒的表达水平，其中检查了茎环结构插入5'未翻译区域，但没有观察到显着差异。此外，使用HeLa细胞产生了野生型MTOR或MTORSL1+的稳定表达应变，并进行了类似的分析，但没有观察到显着差异。这些结果表明，即使在含有足够血清的DMEM培养基中引入了MTORSLI+IT，也很难改善重组蛋白的产生。

项目成果

浸透圧刺激直後におけるMAPキナーゼ経路間特異性維持機構

渗透刺激后立即维持 MAP 激酶通路特异性的机制

• 发表时间: 2008
• 作者: 小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠;高原照直;前田達哉;前田達哉;前田達哉
• 通讯作者: 前田達哉

Isolation of Hyperactive Mutants of Mammalian Target of Rapamycin

• DOI: 10.1074/jbc.m801546200
• 发表时间: 2008-11-14
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Ohne, Yoichiro;Takahara, Terunao;Maeda, Tatsuya
• 通讯作者: Maeda, Tatsuya

活性亢進型TORを用いた酵母TOR経路制御因子の探索

使用高活性 TOR 寻找酵母 TOR 通路调节因子

• 发表时间: 2008
• 作者: 小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠;高原照直
• 通讯作者: 高原照直

Delayed activation kinetics ensures the signalling specificity of the hy perosmotic stress-responsive MAP kinase pathway in yeast

延迟激活动力学确保酵母中高渗应激反应 MAP 激酶途径的信号传导特异性

• 发表时间: 2008
• 作者: 小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠;高原照直;前田達哉;前田達哉
• 通讯作者: 前田達哉

アルカリストレス応答性Rimlol経路をRim9-Rim8とDfg16-Rim8融合タンパク質は活性化できる

Rim9-Rim8 和 Dfg16-Rim8 融合蛋白可激活碱性应激反应 Rimlol 通路

• 发表时间: 2009
• 作者: 小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子;奥山正幸;小林和之;牧孝多朗;田中良幸;西村崇志;本同宏成;中塚大地;西村崇志;Ngiwsara L;田上貴祥;吉田拓弥;Wongchawalit J;貞廣樹里;本同宏成;田上貴祥;Kang MS;本同宏成;Wongchawalit J;Kimura A;Kimura A;Okuyama M;大根陽一郎;大根陽一郎;篠崎翠
• 通讯作者: 篠崎翠