量子ドット・有機・バイオプローブを用いる単一細胞の蛍光ダイナミクス

使用量子点、有机和生物探针的单细胞荧光动力学

基本信息

批准号：
17034026
负责人：
青山安宏
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は細胞内の遺伝子診断のための手法の確立と、核酸プローブを効率よく細胞内に導入するキャリアの開発について検討した。(1)遺伝子診断に関してはモレキュラービーコン型のリボレギュレータを用いる方法を完成し、何の修飾もしていないRNAあるいはDNAプローブをタンパク合成系の培地の中で用いることにより、ターゲット配列を選択的に感度よく(1塩基の違いを識別)、非PCR的シグナル増幅を伴って検出できることを明らかにした。また、RNAaseHを用いるとターゲット/プローブ(DNA/RNA)鎖が非可逆的に切断されるため、シグナルの増幅効率がさらに向上することも明らかになった。(2)核酸プローブの送達に関しては、表面がゾルーゲル反応によりセラミック(シリカ)架橋されたセラソームがウイルスサイズ(数十nm)の粒径をもち、遺伝子(プラスミド)との複合化においても融合せず、もとのウイルスサイズを維持することを明らかにした。その結果、HeLa細胞やHepG2細胞への遺伝子(ルシフェラーゼ)導入において、通常のカチオン性リボソームに比べて2桁から3桁高い活性を有する。セラソームは膜脂質が頑強に架橋されている結果細胞膜との融合も抑制され、したがって細胞毒性もきわめて軽微であり、血清存在下においても高い遺伝子導入効率を保持することも示された。

今年，我们研究了细胞内基因诊断方法的建立以及将核酸探针有效导入细胞的载体的开发。 (1)对于基因诊断，我们已经完成了一种使用分子信标型核糖调节剂的方法，通过在蛋白质合成介质中使用未修饰的RNA或DNA探针，我们可以选择性地高灵敏度地检测目标序列，我们证明可以轻松检测到它。（区分单碱基差异）并伴有非PCR信号放大。研究还表明，RNAaseH 的使用可不可逆地切割靶标/探针 (DNA/RNA) 链，进一步提高信号放大效率。 (2)关于核酸探针的输送，表面通过溶胶凝胶反应与陶瓷(二氧化硅)交联的陶瓷体具有病毒大小(数十纳米)的粒径，即使复合也不会融合与基因（质粒）一起，表明原始病毒大小得以保持。因此，在将基因（荧光素酶）引入 HeLa 细胞和 HepG2 细胞时，它的活性比正常阳离子核糖体高两到三个数量级。由于陶瓷体的膜脂强烈交联，与细胞膜的融合受到抑制，因此细胞毒性极小，并且即使在血清存在下也能保持较高的基因转移效率。