人工転写因子ライブラリーを用いた網羅的遺伝子同定

使用人工转录因子库进行全面基因鉴定

• 批准号: 17019036
• 负责人: 世良 貴史
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17019036/
• 关键词: 遺伝子発現; 転写因子; DNA結合タンパク質

まず、人工転写因子ライブラリー発現ベクターのプリカーサーを作成した。このベクターに人工転写因子遺伝子を導入した発現ベクターを作成し、このベクターでヒト由来細胞HEK293を形質転換し、この遺伝子が効率よく発現されることをウェスタンブロットで確認した。また、人工転写因子ライブラリー作成に必要なすべてのDNAフラグメントのデザインを完了した。まずグアニン(G)が豊富な塩基配列を認識できるように(ヒトのプロモーター配列はGが豊富な場合が多い)、ライブラリー全体の4分の1に該当するDNAフラグメント作成用のDNAオリゴマーを購入し、(部分的な)ライブラリーを作成した。このライブラリーを発現ベクターのプリカーサーに導入したもので大腸菌を形質転換し、生成してきた50個以上のコロニーからDNAベクターを単離し、各々の塩基配列を決定したところ、各DNAフラグメントがランダムにアッセンブルされて、狙い通りの(部分的だが)人工転写因子ライブラリーができることを確認した。こうして得られた人工転写因子ライブラリーをヒト由来細胞に遺伝子導入したが、1回目のセレクション操作における標的の性質を示した細胞の割合が極端に低かったので、現在、遺伝子導入時の実験条件等の最適化を行なっているところである。また、残り4分の3のDNAフラグメント作成用のDNAオリゴマーを購入し、完全なライブラリーの作成も現在行なっているところである。

首先，创建了人工转录因子库表达载体的前体。通过将人工转录因子基因导入到该载体中来创建表达载体，并且用该载体转化人源HEK293细胞，并且通过Western blotting证实该基因有效表达。此外，我们还完成了创建人工转录因子库所需的所有DNA片段的设计。首先，为了识别富含鸟嘌呤（G）的碱基序列（人类启动子序列通常富含G），我们购买了用于创建相当于整个文库四分之一的DNA片段的DNA寡聚物，并创建了（部分）。图书馆。将这个文库导入表达载体前体中，对大肠杆菌进行转化，并从产生的 50 多个菌落中分离出 DNA 载体，当确定每个载体的核苷酸序列时，研究人员发现每个 DNA 片段都是随机组装的。证实他们能够按预期创建一个人工转录因子库（尽管是部分的）。通过这种方式获得的人工转录因子文库被导入人类来源的细胞中，但在第一次选择操作中表现出目标特性的细胞比例极低，因此我们目前正在改变基因导入的实验条件。在优化的过程中。我们还购买了 DNA 寡聚物来创建剩余四分之三的 DNA 片段，目前正在创建一个完整的文库。