光による遺伝子発現調節機構の解析

光分析基因表达调控机制

基本信息

批准号：
12760225
负责人：
永野幸生
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

エンドウ低分子量GTPase遺伝子PRAは暗所生育エンドウの上胚軸で発現しており、光により発現が抑制される。これまで、この遺伝子の発現が光で調節される仕組みを調べてきた。その過程で光応答に必要で十分なシスエレメントDE1をみつけ、さらに、このシスエレメントに特異的に結合するDNA結合タンパク質DF1を同定した。今年度は、DF1の機能解析を進め、光が遺伝子発現を調節する機構に迫った。1)DF1はシスエレメントDE1を介して転写を制御できるかどうかを検討した。35Sプロモーター下でDF1が発現するコンストラクトとタンデムに並んだDE1の後ろに最小プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子をつないだコンストラクトを用いて、パーティクルガンにより遺伝子共導入実験を行った。その結果、暗所でDF1はDE1エレメントを介して遺伝子発現を誘導することがわかった。2)次にDF1の細胞内局在を、GFP融合遺伝子をタマネギ表皮細胞に導入することにより調ぺた。その結果、DF1は核に局在していた。3)DF1は光応答性シスエレメントDE1に結合することからDF1自身が光による制御を受けている可能性が考えられた。そこで、DF1の発現を調べたところ、光照射によりタンパク質量が減少することがわかった。一方、mRNA量は、タンパク質量ほど光照射の影響を受けなかった。すなわち、DF1の量は主として転写後制御機構によって調節されていることが示唆された。4)次にDF1タンパク質の減少がどの光受容体によって調節されているかを検討した。近赤外連続光の照射によって、DF1量は減少したが、赤色連続光や青色連続光の照射による効果はみられなかった。このことはフィトクロムA特異的にDF1量が調節されていることを示している。このことはフィトクロムAの変異株で近赤外連続光がDF1量に影響を与えないことからも確認された。

豌豆低分子GTP酶基因PRA在深色豌豆的上胚轴中表达，其表达受到光的抑制。到目前为止，我们已经研究了光调控该基因表达的机制。在此过程中，他们发现了光响应所必需且充分的顺式元件DE1，并进一步鉴定了与该顺式元件特异性结合的DNA结合蛋白DF1。今年，我们继续分析DF1的功能，以了解光调控基因表达的机制。 1）我们研究了DF1是否可以通过顺式元件DE1控制转录。使用粒子枪进行基因共转移实验，使用其中DF1在35S启动子下表达的构建体和其中最小启动子和荧光素酶基因串联连接在DE1后面的构建体。结果表明，DF1在黑暗中通过DE1元件诱导基因表达。 2)接下来，我们通过将GFP融合基因引入洋葱表皮细胞来研究DF1的细胞内定位。结果表明DF1定位于细胞核。 3) DF1与光响应顺式元件DE1结合，表明DF1本身可能受到光的调节。当我们研究DF1的表达时，我们发现蛋白质的量随着光照射而减少。另一方面，mRNA的量不像蛋白质的量那样受光照射的影响。换句话说，表明DF1的量主要受到转录后控制机制的调节。 4）接下来，我们研究了哪种光感受器调节DF1蛋白的减少。连续近红外光照射使DF1的量减少，但连续红光或连续蓝光照射没有观察到效果。这表明 DF1 的量以光敏色素 A 特异性方式受到调节。连续近红外光不影响光敏色素A突变株中DF1的量这一事实证实了这一点。