人工転写因子ライブラリーを用いた網羅的遺伝子同定

使用人工转录因子库进行全面基因鉴定

• 批准号: 18018025
• 负责人: 世良 貴史
• 金额: $ 5.06万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18018025/
• 关键词: 遺伝子; 発現制御

これまでに狙い通りの人工転写因子ができることを確認したが、作製したDNA結合部位の、人工転写因子発現ベクター用の改良型プリカーサーへのクローニング効率が現在のところ芳しくない。ライゲーションサンプルの大腸菌への形質転換後得られる形質転換体数がそれほど高くなく、今のところ実験に必要な水準を満たしていない。各メーカーのエレクトロコンピテントセルを試してみたが、市販品のエレクトロコンピテントセルでは満足のいく結果が得られなかった。そこでエレクトロコンピテントセルを自作して、多量の形質転換体を得ることを試みた。また得られたベクターの動物細胞への遺伝子導入を行った。すでに報告されている方法に沿って、動物細胞への遺伝子導入を試みたが、その効率は報告されているものより予想以上に低く、様々な導入条件を検討したが、満足のいくものではなかった。そこで各種メーカーの遺伝子導入試薬を用いて、様々な条件の検討を行ったが、5%以上の遺伝子導入効率を得ることはできなかった。また、従来のエレクトロポーレーション法によっても導入効率の改善は見られなかった。しかし、最近報告された新しい方法に基づくエレクトロポーレーション法を用いると、遺伝子導入を大幅に改善することができた。遺伝子導入に用いるパルス電圧、パルスを掛ける時間および回数等の各種条件を検討し、最終的に再現性よく50%以上の効率で遺伝子導入できることを見出した。

尽管到目前为止我们已经证实我们可以创建所需的人工转录因子，但将创建的 DNA 结合位点克隆到改进的人工转录因子表达载体前体中的效率目前很差。连接样品转化大肠杆菌后获得的转化体数量不是很高，目前还没有达到实验所需的水平。我尝试了不同制造商的电感受态细胞，但使用市售的电感受态细胞无法获得满意的结果。因此，我们制作了自己的电感受态细胞，并试图获得大量的转化体。此外，将获得的载体导入动物细胞中。我们尝试使用以前报道的方法将基因导入动物细胞，但效率低于预期，并且考虑了各种导入条件，但没有一个令人满意。因此，使用不同制造商的基因转移试剂研究了各种条件，但不可能获得5%或更高的基因转移效率。此外，即使采用常规的电穿孔方法，也没有观察到导入效率的提高。然而，使用基于最近报道的新方法的电穿孔方法，可以显着改善基因转移。我们研究了基因转移所用的脉冲电压、脉冲时间和次数等各种条件，最终发现基因转移可以重复性良好地进行，效率超过50%。