エピゲノムを標的とした骨粗鬆症に対する新規治療標的分子の探索

针对表观基因组寻找骨质疏松症的新型治疗靶分子

• 批准号: 20K18066
• 负责人: 柳原 裕太
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K18066/
• 关键词: Dnmt1; エピジェネティクス; 軟骨分化; 成長軟骨; エネルギー代謝; Uhrf1; 骨代謝; 骨関節疾患

近年、加齢に伴う疾患の多くは、DNAの塩基配列の変化を伴わない後天的な遺伝子発現の制御機構であるエピゲノムの異常が関わることが分かっている。そこで、我々はエピゲノムの一つであるDNAのメチル化に注目し、骨・関節の恒常性維持のメカニズムの解明に取り組んでいる。本研究において我々はDNAメチル化酵素であるDnmt1を四肢の間葉系幹細胞特異的に欠損させた(cKO)マウスを用い、種々の解析を実施し、当該年度までに次のような結果を得た。cKOマウスの長管骨の骨長はコントロール（Ctrl）マウスの45-60％程度であり、顕著な長管骨の短縮を示した。組織学的解析の結果、1週齢において増殖軟骨層の菲薄化、肥大軟骨層の増大および石灰化の促進を認めた。これらの結果から、cKOマウスでは軟骨細胞分化が促進していることが示唆された。つぎにDnmt1によって発現制御され、軟骨細胞分化に影響を及ぼす遺伝子を同定するため、RNA-SeqとMBD-Seqの統合解析により、Dnmt1欠損に伴うDNAメチル化の減少によって発現増加した遺伝子を絞り込んだ。その結果、DNAメチル化低減により発現上昇した上位4遺伝子がエネルギー代謝に関連していた。そこで当該年度では、細胞内エネルギー代謝に注目し、研究を展開した。メタボローム解析を実施した結果、Dnmt1 cKO軟骨細胞において石灰化に重要な役割を担うATPをはじめ、TCAサイクル及び解糖系の代謝産物のほとんどが高値を示すことが明らかとなった。さらに、Ctrl 軟骨細胞は、グルコースおよびグルタミン不含培地では石灰化が認められなかったが、cKO 軟骨細胞は同じ条件下で石灰化した。これらのことから、DNAメチル化維持機構は、軟骨細胞エネルギー代謝を介して軟骨細胞の石灰化による骨格形成を制御している可能性が示唆された。

近年来，人们发现许多与年龄相关的疾病都与表观基因组的异常有关，表观基因组是一种后天获得的基因表达控制机制，不涉及DNA碱基序列的变化。因此，我们将重点放在作为表观基因组一部分的DNA甲基化上，并致力于阐明维持骨和关节稳态的机制。在这项研究中，我们使用四肢间充质干细胞（cKO）中DNA甲基转移酶Dnmt1被特异性删除的小鼠进行了各种分析，并在本财年获得了以下结果。 cKO小鼠的长骨长度约为对照（Ctrl）小鼠的45-60%，表明长骨显着缩短。组织学分析的结果是，1周龄时观察到增殖软骨层变薄、肥大软骨层增加、钙化促进。这些结果表明 cKO 小鼠中软骨细胞分化得到促进。接下来，为了鉴定表达受 Dnmt1 调节并影响软骨细胞分化的基因，我们使用 RNA-Seq 和 MBD-Seq 的整合分析来缩小由于 Dnmt1 缺陷相关的 DNA 甲基化减少而表达增加的基因。结果，由于DNA甲基化减少而表达增加的前四个基因与能量代谢有关。因此，今年我们的研究重点是细胞内能量代谢。代谢组分析显示，Dnmt1 cKO 软骨细胞显示出高水平的 TCA 循环和糖酵解的大部分代谢物，包括在矿化中发挥重要作用的 ATP。此外，Ctrl 软骨细胞在不含葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中不矿化，而 cKO 软骨细胞在相同条件下矿化。这些发现表明DNA甲基化维持机制可能通过软骨细胞能量代谢通过软骨细胞钙化来控制骨骼形成。

项目成果

Dnmt1は成長軟骨の正常発達に必須である

Dnmt1 对于生长软骨的正常发育至关重要

• 发表时间: 2020
• 作者: 柳原裕太

Dnmt1 maintains normal differentiation of growth plate chondrocytes

Dnmt1维持生长板软骨细胞的正常分化

• 发表时间: 2022
• 作者: Yuta Yanagihara; Yuuki Imai
• 通讯作者: Yuuki Imai