人工転写因子を用いたがん増殖シグナルの人為的操作

使用人工转录因子人工操纵癌症生长信号

• 批准号: 17012013
• 负责人: 世良 貴史
• 金额: $ 5.44万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17012013/
• 关键词: 遺伝子発現; がん; 転写因子; 血管内皮増殖因子

ヒトVEGFプロモーターを認識する人工DNA結合タンパク質に、種々の転写抑制ドメインをつないだ人工転写因子遺伝子をCMVプロモーターの下流に導入したヒト細胞発現ベクターを作成した。さらに、VEGFプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結させたルシフェラーゼ・リポーターを作成し、ヒト由来細胞HEK293を用いて、どの人工転写因子(あるいは転写抑制ドメイン)がルシフェラーゼ発現量を最も抑制するかを定量できる系を確立した。このアッセイ系を用いて、KRAB転写抑制ドメインと同等もしくはそれ以上の活性を有するドメインを複数得ることに成功した。現在、その再現性を慎重に調べているところである。また、内在性のVEGF遺伝子の発現量をそのタンパク質生成量に基づいて定量できる系も確立した。また、同時に人工転写因子タンパク質そのものの細胞導入によるVEGF発現抑制も試みた。現在、上述したように最も効果的な抑制ドメインの探索を行なっているので、まずKRAB転写抑制ドメインを有する人工転写因子に種々の細胞膜透過ペプチドを繋げたタンパク質の大腸菌発現ベクターを作成した。このうち、細胞膜透過ペプチドPTD-4を連結した人工転写因子タンパク質を大腸菌で過剰発現させ、その精製を完了した。上述したルシフェラーゼ・リポーター・アッセイ系において、このタンパク質導入により、同一タンパク質非存在下のルシフェラーゼ遺伝子発現量の10%にまで抑制できることを確認した。

我们创建了一种人类细胞表达载体，其中将人工转录因子基因引入到 CMV 启动子下游，其中各种转录抑制域与识别人类 VEGF 启动子的人工 DNA 结合蛋白连接。此外，我们通过将荧光素酶基因连接到 VEGF 启动子下游，创建了荧光素酶报告基因，并使用人源 HEK293 细胞，我们能够量化哪种人工转录因子（或转录抑制结构域）最能抑制荧光素酶表达系统的量。成立。使用该检测系统，我们成功获得了多个活性等于或大于 KRAB 转录抑制结构域的结构域。我们目前正在仔细研究其再现性。我们还建立了一个系统，可以根据产生的蛋白质量来量化内源 VEGF 基因的表达水平。同时，我们还尝试通过将人工转录因子蛋白本身引入细胞中来抑制VEGF的表达。如上所述，我们目前正在寻找最有效的抑制结构域，因此首先我们创建了一种蛋白质的大肠杆菌表达载体，其中各种细胞膜穿透肽与具有 KRAB 转录抑制结构域的人工转录因子连接。其中，与细胞膜穿透肽PTD-4连接的人工转录因子蛋白在大肠杆菌中过表达，并完成了纯化。在上述荧光素酶报告基因测定系统中，确认通过导入该蛋白质，可以将荧光素酶基因的表达水平抑制至不存在相同蛋白质时的水平的10％。