細胞接着・運動におけるDockファミリー蛋白質の機能及びその活性制御機構の解析

Dock家族蛋白在细胞粘附和运动中的功能及其活性控制机制分析

基本信息

批准号：
17014049
负责人：
加藤裕教
金额：
$ 4.99万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17014049/
关键词：
Rho 細胞運動低分子量G蛋白質インテグリン

项目摘要

がん細胞の浸潤・転移に深く関連のある細胞接着や運動に関して、Rhoファミリーの低分子量G蛋白質の関与がこれまでにも数多く報告されている。最近Dock180に代表される、新しいタイプのRhoファミリーG蛋白質活性化因子(Dockファミリー)の存在が明らかになった。本研究では、我々が新しく見出したDock180の活性制御メカニズムがインテグリンによる細胞の接着や運動に関与しているか否かを調べる目的で、RNA干渉によりRhoGの発現を特異的に抑制させたHeLa細胞を樹立し解析を行った。具体的にはヒトRhoGを特異的にノックダウンさせる短いヘアピン構造のRNAを発現することができるベクターをHeLa細胞に導入し、安定にそのヘアピン構造のRNAを発現する細胞を樹立した。合わせてコントロールの短いヘアピン構造のRNAを安定に発現することができる細胞も樹立し、コントロール細胞として用いた。これらの細胞をファイブロネクチンでコートした培養皿上にまいたところ、親細胞やコントロールの細胞では15分後に細胞膜の伸展とラッフリングの形成が見られたが、RhoGノックダウン細胞ではそれらの形成が抑制されていた。次に細胞運動への影響を、Wound healing assay及びTranswell assayの2通りの系で調べてみたところ、どちらの系においてもRhoGノックダウン細胞はその運動能が有意に抑制されていることが確認された。特にWound healing assayの系においては、細胞が運動する方向の先端に作られるラメリポディアの形成及び細胞内のRac1の活性が有意に抑制されていることが観察された。一方RhoGノックダウン細胞における運動能の低下は、ELMOとDock180を過剰発現することにより回復した。以上の結果から、活性化されたRhoGがELMO-Dock180複合体を細胞膜へと移行させ、そこでRacを活性化して細胞膜のラッフリングとそれに伴って起こる膜の伸展が起こり、細胞の接着や運動を促進することが明らかになった。

迄今为止，已经有许多报道称低分子量G蛋白来自Rho家族在细胞粘附和运动方面的参与，这与癌细胞浸润和转移密切相关。最近，已经揭示了由Dock180代表的新型Rho家族G蛋白激活剂（Dock家族）的存在。在这项研究中，我们建立了和分析了通过RNA干扰特异性抑制RHOG表达的HELA细胞，目的是检查DOCK180活性控制的新发现的机制是否参与整合素的细胞粘附和运动。具体而言，能够表达特异性击倒人类RHOG的短发夹RNA的载体被引入HELA细胞中，并且建立了稳定表达具有发夹结构的RNA的细胞。此外，还建立了能够稳定表达用短发夹结构的RNA的细胞，并用作对照细胞。当这些细胞分布在覆盖纤连蛋白的培养皿上时，父和对照细胞在15分钟后显示出细胞膜的延伸和皱纹形成，但是RHOG敲低细胞抑制了它们的形成。接下来，我们研究了两个系统中对细胞运动的影响：伤口愈合测定和Transwell分析，并确认RHOG敲低细胞的运动性在这两个系统中都受到了显着抑制。特别是，在伤口愈合测定系统中，观察到在细胞运动尖端产生的薄片的形成，并且细胞内Rac1的活性得到了显着抑制。另一方面，通过过表达Elmo和Dock180，RHOG敲低细胞中的运动能力下降。从上面的结果中，揭示了活化的RHOG将Elmo-Dock180复合物迁移到细胞膜，RAC激活，导致细胞膜和相关的膜延伸，从而促进细胞粘附和运动。