1分子力学・蛍光測定によるフォールディングダイナミクスの研究

利用单分子动力学和荧光测量研究折叠动力学

• 批准号: 16041209
• 负责人: 佐野 雅己
• 金额: $ 8.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16041209/
• 关键词: DNA凝縮転移; タンパク質フォールディング; AFM(原子間力顕微鏡); 1分子計測; たんぱく質フォールディング; レーザーピンセット

1.我々はDNA結合色素,YO-PRO2+、YOYO4を用いて、スペルミジン3+(SPD)による凝縮転移下で対イオンの振舞いを調べた。色素とSPDは共に正電荷を持つため、DNAの負電荷に対し対イオンとして振舞う。また、色素はDNAと結合しているときのみ強い蛍光を発する。一定量の色素とDNAを含む溶液に対しSPDを加えると、蛍光強度はSPD濃度の増加にともない単調に減少することを確認した。これはDNAの負電荷を遮蔽する対イオンが、色素からSPDに置換わったことを示している。さらに興味深いことに、あるSPD濃度において蛍光強度の減衰の仕方が大きく変化する。沈降法による測定から、この濃度が凝縮転移濃度に一致することが分かった。得られた理論曲線は測定結果をよく再現した。2.さらに、光ピンセットを用いた1分子DNAの張力測定により、1分子DNA上におけるYOYO, SPDの対イオン交換を観測することに成功した。YOYOがDNAにインターカレートすると、DNAの見かけの全長が長くなることが知られている。張力測定の結果、YOYOの結合により全長が増加するが、SPDの添加で再度減少することが分かった。全長の減少はYOYOの解離を意味しており、1分子DNA上でYOYO、SPDの対イオン交換が生じていることを示している。3.原子間力顕微鏡(AFM)を自作し、伸張緩和速度を任意に設定可能にするとともに、力一定(Force clamo)モードや力の増加割合一定(Force ramp)モードなどで動作することを可能にした。このAFMを用いてフォールド過程研究のモデルたんぱく質であるSNase(Staphy lococcal Nuclease)の1分子伸張実験を行った。鋸波状の応答のピーク間隔分布の解析から、引っ張り力が100-400pNの比較的弱い力の範囲では、アンフォールドによる長さ変化が2-6nmの短い構造変化、力が400-600pNの比較的強い力の範囲では、14nm以上の長い構造変化が起こっていることが明らかになった。4.DNA1分子の伸張実験で観測された3種類の力学応答:WLC,プラトー、鋸波状応答の生成機構を明らかにするため、静電相互作用を考慮したランジュバンダイナミクスモデルを構築し、数値シミュレーションを行った。その結果、静電相互作用を強くするに従い、3種の力学応答が再現されることを確認した。

1. 我们使用 DNA 结合染料 YO-PRO2+ 和 YOYO4 来研究抗衡离子在亚精胺 3+ (SPD) 诱导的缩合转变下的行为。由于染料和 SPD 都带有正电荷，因此它们充当 DNA 负电荷的反离子。此外，该染料只有在与 DNA 结合时才会发出强烈的荧光。已证实，当将 SPD 添加到含有固定量染料和 DNA 的溶液中时，随着 SPD 浓度的增加，荧光强度单调降低。这表明屏蔽 DNA 负电荷的抗衡离子已被染料中的 SPD 取代。更有趣的是，在一定的SPD浓度下，荧光强度衰减的方式发生显着变化。通过沉降法测定，该浓度相当于缩合转变浓度。获得的理论曲线很好地再现了测量结果。 2.此外，通过使用光镊测量单分子DNA的张力，我们成功观察到单分子DNA上YOYO和SPD的抗衡离子交换。已知当YOYO插入DNA时，DNA的表观总长度增加。张力测量表明，由于 YOYO 的结合，总长度增加，但随着 SPD 的添加，总长度再次减少。总长度的减少意味着YOYO解离，表明YOYO和SPD的抗衡离子交换发生在单个DNA分子上。 3. 构建自己的原子力显微镜（AFM），并可以任意设置拉伸弛豫率，以及在恒力（Force clamo）模式、恒力增加率（Force Ramp）模式等下操作。我做了它。使用该 AFM，我们进行了 SNase（葡萄球菌核酸酶）的单分子延伸实验，SNase 是一种用于折叠过程研究的模型蛋白。对锯齿响应峰间距分布的分析表明，在100-400 pN相对较弱的拉力范围内，展开引起的长度变化是2-6 nm的短结构变化，而在400-600 pN，由于展开而产生的长度变化是2-6 nm的短结构变化，表明在强力范围内会发生14 nm或更长的长结构变化。 4. 为了阐明单个DNA分子拉伸实验中观察到的三种机械响应：WLC、平台和锯齿响应的产生机制，我们构建了考虑静电相互作用的Langevin动力学模型并进行了数值模拟。去了。结果，我们确认随着静电相互作用的加强，再现了三种类型的机械响应。

项目成果

A Mechanical Model of Molecular Motors with Load Dependent Transitions

具有负载相关跃迁的分子马达机械模型

• 发表时间: 2006
• 期刊: Prog.Theor.Phys.Supp. (印刷中)
• 作者: T.Ishii;M.Matsuo;M.Sano
• 通讯作者: M.Sano

Connectivities and Synchronous Firing of Cortical Neural Networks.

皮质神经网络的连接和同步放电。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Phys.Rev.Lett. 93
• 作者: L.C.Jia;M.Sano;Pik-Yin Lai.;C.K.Chan
• 通讯作者: C.K.Chan

Visualization during stick-release and plateau responses of collapsed DNA

塌陷 DNA 棒释放和平台反应期间的可视化

• 发表时间: 2006
• 期刊: Prog.Theor.Phys.Supp. (印刷中)
• 作者: R.Ishida;Y.Murayama;M.Sano
• 通讯作者: M.Sano

Nonlinear Elasticity of Single Collapsed Polyelectrolytes

单一塌陷聚电解质的非线性弹性

• 发表时间: 2005
• 期刊: Physical Review E 72
• 作者: H.Wada;Y.Murayama;M.Sano
• 通讯作者: M.Sano

Exchange of Counterions in DNA Condensation

DNA 缩合中抗衡离子的交换

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biopolymers (印刷中)
• 作者: Y.Murayama;M.Sano
• 通讯作者: M.Sano