Development of the reconstituted folding/translation-coupled system to analyze relevant diseases

开发重建折叠/平移耦合系统来分析相关疾病

基本信息

批准号：
22H02612
负责人：
今高寛晃
金额：
$ 11.15万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒト因子由来再構成型翻訳システムに、ヒト細胞質主要シャペロンタンパク質（シャペロニンCCT, 新生鎖結合シャペロンNAC, リボソーム結合シャペロンRAC, Hsp70s, Hsp90s, プレフォルディン）を添加することにより再構成型翻訳・細胞質フォールディング連動システムシステム（細胞質タンパク用）を樹立した。次に再構成型翻訳・SRP連結システムの開発を進めた。まずSRPの再構成に取り組んだ。SRPは302ntのRNA (7SL RNA)とSRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72といった６種類のタンパク質から成る。7SL RNA はin vitroの転写によって得た。SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72をHeLa細胞抽出液再構成系及び再構成系で発現するシステムを整えた。また、これらをT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）で同時発現するシステムを構築した。次にSRPリセプター（SRa, SRb）及びSec61トランスロコン（Sec61a, Sec61b, Sec61g）を発現するシステムをHeLa細胞抽出液再構成系、再構成系そしてT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）にて構築した。これらは複合体であるため、共発現、または単独発現＋混合　という二つの戦略に関しての条件検討を行った。目下のところSRP, SR, Sec61いずれもHeLa細胞抽出液再構成系で発現し、FLAGカラムを利用して複合体を精製するという方法が最も効率が良いことがわかった。次年度はこのシステムを利用して、リコンビナントSRP, SRa/SRb/Sec61a/b/g　を精製し、再構成系とliposome上で「再構成型翻訳・SRP連結システム」を構築していく。

通过将人细胞质主要伴侣蛋白（伴侣蛋白 CCT、新生链结合伴侣 NAC、核糖体结合伴侣 RAC、Hsp70s、Hsp90s、前折叠蛋白）添加到人源重组翻译系统中，可以实现重构翻译和细胞质折叠。建立了一个连锁系统（针对细胞质蛋白）。接下来，我们继续开发可重构的翻译/SRP联动系统。首先，我们致力于重新配置 SRP。 SRP由302nt RNA（7SL RNA）和六种类型的蛋白质组成，包括SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68和SRP72。通过体外转录获得7SL RNA。我们制备了在HeLa细胞提取物重构系统和重构系统中表达SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68和SRP72的系统。我们还构建了一个在 T7 RNP 痘苗病毒系统（BHK 细胞）中共表达这些的系统。接下来，使用HeLa细胞提取物重构系统、重构系统和T7 RNP痘苗病毒系统（BHK细胞）构建表达SRP受体（SRa、SRb）和Sec61易位子（Sec61a、Sec61b、Sec61g）的系统。由于这些是复合体，我们研究了两种策略的条件：共表达或单一表达+混合。目前，我们发现最有效的方法是在重构的 HeLa 细胞提取物系统中表达 SRP、SR 和 Sec61，并使用 FLAG 柱纯化复合物。明年，我们将利用该系统精制重组SRP，SRa/SRb/Sec61a/b/g，并利用重组系统和脂质体构建“重组翻译/SRP联动系统”。

项目成果

期刊论文数量（8）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

2Aペプチド自己切断阻害剤のスクリーニング

2A肽自裂解抑制剂的筛选

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Miki Seiya三木世良哉;Machida Kodai(町田幸大);Imataka Hiroaki(今高寛晃)
通讯作者：
Imataka Hiroaki(今高寛晃)

ポリアミンがCAG リピート由来の非標準翻訳に与える影響

多胺对 CAG 重复序列非规范翻译的影响

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
町田幸大;今高寛晃
通讯作者：
今高寛晃

In vitro reconstitution and elucidation of noncanonical translation

非规范翻译的体外重建和阐明

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
町田幸大;辻本宗佑;砂川真弓;今高寛晃
通讯作者：
今高寛晃

In vitro analysis of noncanonical Translation

非规范翻译的体外分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
町田幸大;辻本宗佑;砂川真弓;今高寛晃;Hiroaki IMATAKA
通讯作者：
Hiroaki IMATAKA

無細胞翻訳系を用いたSCA36に関わるリピート関連非AUG(RAN)翻訳の分子機構解析

使用无细胞翻译系统分析与 SCA36 相关的重复相关非 AUG (RAN) 翻译的分子机制

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Hayato Ito;Kodai Machida;Morio Ueyama;Yoshitaka Nagai;Hiroaki Imataka;Hideki Taguchi;蓮見真由美　伊藤隼人　町田幸大　永井義隆　今高寛晃　田口英樹
通讯作者：
蓮見真由美　伊藤隼人　町田幸大　永井義隆　今高寛晃　田口英樹