真核細胞再構成翻訳系の樹立:翻訳におけるストレス反応機構研究のために

真核细胞重建翻译系统的建立：用于研究翻译中的应激反应机制

基本信息

批准号：
17026039
负责人：
今高寛晃
金额：
$ 3.2万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

eIF3は真核細胞の翻訳因子では最大(650kDa)の翻訳開始因子であり、11個の異なるサブユニット(eIF3a, eIF3b, eIF3c, eIF3d, eIF3e, eIF3f, eIF3g, eIF3h, eIF3i, eIF3k, eIF3l)から構成されている。eIF3は翻訳開始に必須であり、中心的役割を果たしている。特にストレス状況下における翻訳制御に関わっていることが知られている。しかし、各々のサブユニットが何をしているのか、どのサブユニットがeIF3のコアを形成しているのか不明であった。そこで我々はヒトのeIF3の再構成を行い各サブユニットの解析を行った。方法はバキュロウイルスによる共発現システムを用いた。三つまたは四つのサブユニットを発現するバキュロウイルスを三つ作製した。これらのウイルスを昆虫細胞に同時に感染させることにより、11個のサブユニットを同時に細胞内で発現させ、細胞抽出液から組み換え体eIF3を精製した。このようにして得られたeIF3はHeLa細胞などから精製された内因性eIF3と同じ組成と同じ活性を有していた。次にどのサブユニットがeIF3の構造と機能に必要なのかを調べた。任意の一つのサブユニットを欠損したeIF3の作製を試み、その活性を測定した。11個のサブユニットの中で、eIF3d, eIF3g, eIF3i, eIF3k, eIF3lサブユニットはそれぞれ欠損させてもeIF3は構造を維持し、また活性にも大きく影響を与えなかった。従って、これら五つのサブユニットは必須でないことがわかった。残りの六つのサブユニットeIF3a, eIF3b, eIF3c, eIF3e, eIF3f, eIF3hは欠損させることができなかった。最後にこれらの六つのサブユニットで活性のあるeIF3を作製することに成功した。

eIF3 是真核细胞中最大的 (650 kDa) 翻译起始因子，由 11 个不同的亚基（eIF3a、eIF3b、eIF3c、eIF3d、eIF3e、eIF3f、eIF3g、eIF3h、eIF3i、eIF3k、eIF3l）组成。 eIF3 对于翻译起始至关重要，并发挥着核心作用。众所周知，它参与翻译控制，尤其是在压力条件下。然而，目前尚不清楚每个亚基的作用以及哪些亚基构成 eIF3 的核心。因此，我们重建了人类eIF3并分析了每个亚基。该方法使用杆状病毒共表达系统。产生了表达三个或四个亚基的三种杆状病毒。通过用这些病毒同时感染昆虫细胞，细胞中同时表达11个亚基，并从细胞提取物中纯化出重组eIF3。由此获得的eIF3具有与从HeLa细胞等纯化的内源性eIF3相同的组成和活性。接下来，我们研究了 eIF3 的结构和功能需要哪些亚基。我们尝试创建缺乏任何一个亚基的 eIF3 并测量其活性。在这11个亚基中，即使eIF3d、eIF3g、eIF3i、eIF3k和eIF3l亚基被删除，eIF3仍保持其结构，并且活性没有受到显着影响。因此，发现这五个亚基不是必需的。其余六个亚基 eIF3a、eIF3b、eIF3c、eIF3e、eIF3f 和 eIF3h 无法删除。最终，他们利用这六个亚基成功创建了活性 eIF3。