トランスジーンの不活性化欠如がもたらす胚性幹細胞の分化異常の解明

阐明因缺乏转基因失活而导致的胚胎干细胞分化异常

• 批准号: 15039204
• 负责人: 谷本 啓司
• 金额: $ 3.14万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15039204/
• 关键词: ES細胞; Cre-loxP反応; ROSA-26

本研究の第一段階として、外来導入遺伝子の活性を常に同一の染色体環境下において検証することを目的とし、染色体が常に開いた構造を持つと考えられるES細胞のROSA遺伝子座に対して、Cre-loxP反応を利用してカセット式にDNA断片を挿入する系(Recombination-mediated cassette exchange ; RMCE法)の確立を目指している。1.ROSA遺伝子座へのタンデムloxP配列の挿入:ROSA遺伝子座への相同組換え用DNA断片(pROSA-1;Soriano博士より入手)中に、野性型loxP配列と変異型のloxP511配列を挿入(逆タンデム方向)後、これらの間にポジティブ選別用のネオマイシン耐性遺伝子とネガティブ選別用のTK遺伝子を挿入し、ターゲティング・ベクターとした。2.上記ベクターを用いて、ES細胞(R1株)において相同組換えを行った。ROSA26遺伝子座では高効率に相同組み換えが起こることが知られているが、今回25%の効率で正しく組換えを起こしたクローン(R1-ES/loxP-TK-Neo)を得ることができた。これらのクローンのいくつかについて生殖系列への分化能の確認を行った。3.RMCE法の有効性を検討するために、R1-ES/loxP-TK-Neo細胞中のloxP/loxP511配列と同様のconfigurationを持つベクター中にβ-gal遺伝子を挿入した「基質」プラスミドを構築した。現在、Hygromycinによる選別とlacZ染色を指標として、Cre発現ベクターの選定やエレクトロポレーションの条件検討を行っている。

作为这项研究的第一步，在同一染色体环境中，门诊引入基因的目的始终是验证的，而Cre cre cre osa rosa基因被认为具有开放的结构。 ）使用-LoxP反应将DNA片段插入盒式盒式磁带。 1。将串联LOXP序列插入ROSA属：插入野生型LOXP序列和突变的LOXP511序列在DNA片段（从Soriano博士中获得）（从Soriano博士获得）到Rosa Genza到反向tandem，Neomycin-抗性基因，以获得阳性选择和阳性选择和阳性选择和插入了用于分类阴性的TK基因，使其成为靶向载体。 2。使用上面的向量重新组合ES细胞（R1共享）。众所周知，Rosa26 Genza已知具有高效率，但是这次获得了克隆（R1-ES/LOXP-TK-NEO），并获得了25％的效率重新组合。我们将其中一些克隆确认为生殖分支机构。 3。为了检查RMCE方法的有效性，在细胞中，在R1-ES/LOXP-TK-NEO LOXP/LOXP511中，用β-GAL基因插入了“底物”质粒。当前，正在使用湿霉素的分类和LACZ染色来检查CRE表达载体和电穿孔条件的选择。