YAC-TgMを用いた受精後メチル化インプリンティング成立・維持機構の解明

利用YAC-TgM阐明受精后甲基化印记的建立和维持机制

基本信息

批准号：
18051003
负责人：
谷本啓司
金额：
$ 3.39万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

ゲノム刷り込みを受けるIgf2/H19遺伝子座では、由来する親の性特異的なICR(Imprinting Control Region)のメチル化状態(メチル化インプリンティング;MI)が各遺伝子の発現パターンを規定する。我々は、ヘテロな遺伝子座(ヒト・βグロビン遺伝子座)にICRを移植した酵母人工染色体(YAC)の遺伝子導入マウス(TgM)を作製・解析し、ICRDNA断片のみでゲノム刷り込みが再現されることを明らかにした。しかしながら、同系においては、導入ICRのMIは、精子生殖細胞中ではなく、受精後に両親からのゲノムが共存する環境下で起こることが示唆された。以上の結果から2つの疑問が生じた。1)精子生殖細胞中でICRがMIを受けるために必要な条件は何なのか?2)受精後メチル化刷り込みに必要なICR内のDNA情報の本体は何なのか?これらの疑問を解明するために、以下の実験を行った。(i)CTCF結合配列欠損型ICR(constitutive negative CTCF binding site)をβグロビン遺伝子座内に持つYAC-TgMを作製し、ICRのメチル化状態を体細胞、精子・卵生殖細胞、初期胚において解析した。(ii)同様の実験を、CpG motif欠損型ICR(constitutive active CTCF binding site)についても行った。以上の結果から、CTCF結合配列が受精後メチル化刷り込みの確立、あるいは維持のどちらかに関与することが示された。(iii)ICR DNA 断片のみを1コピーから複数コピー導入したTgMを作製し、精子生殖細胞内メチル化とCpG配列の数(頻度)との関係を明らかにすることを試みた。この結果、ICRのコピー数が精子生殖細胞内メチル化に関する絶対的なシグナルとなっているわけではないことが示された。

在经历基因组印记的IGF2/H19基因座上，甲基化状态（甲基化的印迹； MI）的父母性别特异性ICR（烙印控制区域）的起源是从中定义了每个基因的表达模式。我们在异源基因座（人类β-蛋白基因座）中生产并分析了用ICR移植的酵母人工染色体（YAC）的转基因小鼠（TGM），并揭示了仅使用ICRDNA片段仅复制基因组印迹。然而，在同一物种中，有人提出转染的ICR中的MI不发生在精子细胞中，而是在受精后父母共存的基因组并存的环境中。以上结果提出了两个问题。 1）ICR在精子细胞中接受MI需要什么条件？ 2）在侵占后甲基化所需的ICR中的DNA信息的主体是什么？为了澄清这些问题，进行了以下实验。（i）制备了携带CTCF结合序列缺陷的ICR（组成型负CTCF结合位点）的YAC-TGM，制备了β-珠蛋白基因座中的YAC-TGM，并在体细胞，精子/Ogerm细胞和早期胚胎中分析了ICR的甲基化状态。（ii）在CPG基序缺陷的ICR（组成型活性CTCF结合位点）上也进行了类似的实验。以上结果表明，CTCF结合序列参与了受精后建立或维持甲基化印记。（iii）我们创建了TGM，其中从一个副本中引入了多个ICR DNA片段的副本，并试图阐明精子生殖细胞甲基化与CpG序列的数量（频率）之间的关系。这表明ICR的拷贝数不是精子生殖细胞甲基化的绝对信号。