真核生物の染色体DNA複製再構成系の確立

真核染色体DNA复制和重排系统的建立

基本信息

批准号：
14033230
负责人：
水島徹
金额：
$ 3.07万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14033230/
关键词：
DNA複製 ORC Orc5p ATP 活性調節安定化 Cdc6p ATPase

项目摘要

大腸菌の複製開始因子DnaAはATPと結合し、このATP結合活性が細胞内DNA複製に必須であることが遺伝学的に証明されている。一方真核生物の複製開始因子ORC(Origin Recognition Complex)はATPと結合する二つのサブユニット(Orc1pとOrc5p)を持っている。この内、Orc1PのATP結合活性に関しては、細胞内DNA複製に必須であることが遺伝学的に証明されているが、Orc5pのATP結合活性に関しては全く分かっていなかった。そこで我々はATPと結合出来ないOrc5pを発現している変異株(ORC5-A)を作成しその解析を行った。我々はORC5-A株が温度感受性を示すことを見出し、Orc5pのATP結合活性も細胞内DNA複製において重要な役割を果たしていることを示した。さらに我々は、ORC5-A株では、高温で細胞内のORCが不安定になっていること、及びその原因として、ユビキチン・プロテアソーム系が活性化されていることを見出した。さらにORCのサブユニットの一つであるOrc4pを多量発現すると、このORCの不安定化が抑圧されることを発見した。この抑圧はOrc4p特異的であり、他のサブユニットでは見られなかった。以上の結果は、Orc5pのATP結合が細胞内でORCが安定に存在するために必須であること、及びその理由として、Orc5pがそのATP結合依存的にOrc4pと結合することを示唆している。

大肠杆菌的复制起始因子 DnaA 与 ATP 结合，并且基因证明这种 ATP 结合活性对于细胞内 DNA 复制至关重要。另一方面，真核复制起始因子ORC（起源识别复合物）有两个与ATP结合的亚基（Orc1p和Orc5p）。其中，Orc1P的ATP结合活性已被基因证明对于细胞内DNA复制至关重要，但Orc5p的ATP结合活性仍然完全未知。因此，我们创建了表达不能与 ATP 结合的 Orc5p 的突变菌株（ORC5-A），并对其进行了分析。我们发现 ORC5-A 菌株对温度敏感，并表明 Orc5p 的 ATP 结合活性在细胞内 DNA 复制中也发挥着重要作用。此外，我们发现在ORC5-A菌株中，细胞内的ORC在高温下变得不稳定，其原因是泛素蛋白酶体系统被激活。此外，他们发现，当大量表达 ORC 亚基之一的 Orc4p 时，ORC 的不稳定会受到抑制。这种抑制是 Orc4p 特异性的，在其他亚基中没有观察到。上述结果表明，Orc5p的ATP结合对于ORC在细胞中的稳定存在至关重要，并且Orc5p以依赖于其ATP结合的方式与Orc4p结合。