宿主B細胞を利用したHIV-1遺伝子高頻度突然変異誘導機構

利用宿主B细胞的HIV-1基因超突变诱导机制

基本信息

批准号：
14021118
负责人：
北村大介
金额：
$ 3.71万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

後天性免疫不全症候群を引き起こすHIV-1は高率に変異を起こし、これが抗HIV薬剤耐性のみならず、宿主の獲得免疫応答をウィルスが回避する原因となっている。HIV-1ゲノムの高変異性は逆転写酵素に起因するとされているが、最近、HIV-1遺伝子産物にRNA editingが見出されるなど、宿主側の何らかの機構も寄与している可能性がある。In vitroでHIV-1が活性化B細胞に感染し複製しうること、HIV関連リンフォーマが胚中心B細胞に由来し、HIV-1プロウィルスを有することなどから、感染者において胚中心B細胞にはHIV-1が感染しうると思われる。胚中心B細胞では、免疫グロブリン(Ig)遺伝子に高率に突然変異が起こるが、これはIg遺伝子エンハンサー領域およびそれに基づく転写に依存する。Igエンハンサーに働くいくつかの転写因子はHIV-1のLTRにも作用するので、HIV-1プロウィルス遺伝子はIg遺伝子と同様に活性化刺激により転写誘導され、突然変異誘導活性の標的となっている可能性が考えられる。これを検証するために、pol遺伝子の一部を除いたHIV-1プロウィルスを有するトランスジェニックマウス(東大医科研・岩倉洋一郎博士より)を用いた。Ig遺伝子突然変異が蓄積する5ヶ月令以降のマウスのパイエル板から胚中心B細胞を分離し、そのゲノムDNAからgp120 V3,V4 loop部分をPCR法にて増幅し、塩基配列を決した。その結果、変異の頻度は約1x10^<-4>で、Ig遺伝子の変異頻度(約10^<-2>)に比較すると低いが、PCRのエラー率(10^<-7>)よりはるかに高いので、染色体DNAに発生した変異であると考えられた。変異率が比較的低い理由については、トランスジーンの挿入部位の発現への影響やコピー数が多い(約10コピー)ことが影響している可能性がある。これらの可能性を考慮して、新たにコピー数の少ないHIV-1プロウィルスのトランスジェニックマウスを作製することにした。ES細胞にHIV-1Δpol遺伝子を導入し、1〜2コピー挿入された細胞を同定した。今後、このES細胞を用いてキメラマウスを作製する。

导致获得性免疫缺陷综合症的HIV-1突变率很高，这不仅会导致抗HIV药物产生耐药性，还会导致病毒逃避宿主获得性免疫反应的能力。 HIV-1基因组的高度变异性据说是由逆转录酶引起的，但宿主方面的一些机制也可能有所贡献，因为最近在HIV-1基因产物中发现了RNA编辑。由于HIV-1可以在体外感染活化的B细胞并在其中复制，并且由于HIV相关淋巴瘤源自生发中心B细胞并携带HIV-1原病毒，因此生发中心B细胞被认为可以将HIV-1传播给人们。在生发中心 B 细胞中，免疫球蛋白 (Ig) 基因的突变发生率很高，这取决于 Ig 基因增强子区域及其转录。由于一些作用于Ig增强子的转录因子也作用于HIV-1的LTR，因此与Ig基因相似，HIV-1原病毒基因可能被激活刺激转录诱导，并成为诱变活性的目标。为了验证这一点，我们使用了携带 HIV-1 原病毒且部分 pol 基因被去除的转基因小鼠（来自东京大学医学科学研究所 Yoichiro Iwakura 博士）。当Ig基因突变积累时，从5个月或以上的小鼠派尔氏斑中分离生发中心B细胞，通过PCR从基因组DNA中扩增gp120 V3、V4环区，并测定核苷酸序列。结果，突变频率约为1x10^<-4>，低于Ig基因的突变频率（约10^<-2>），但远高于PCR的错误率（10^<- 7>)。人们认为这是染色体DNA中发生的突变。相对较低的突变率可能是由于转基因插入位点对表达的影响以及大量的拷贝数（大约10个拷贝）。考虑到这些可能性，我们决定创造具有低拷贝数 HIV-1 原病毒的新转基因小鼠。我们将 HIV-1Δpol 基因导入 ES 细胞，并鉴定出插入了 1 至 2 个拷贝的细胞。未来，我们将利用这些ES细胞来培育嵌合小鼠。