宿主B細胞を利用したHIV-1遺伝子高頻度突然変異誘導機構

利用宿主B细胞的HIV-1基因超突变诱导机制

基本信息

批准号：
13226118
负责人：
北村大介
金额：
--
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

AIDSの原因ウィルスであるHIV-1は高率に変異を起こし、これが薬剤耐性、宿主獲得免疫応答回避の原因となっている。HIV-1ゲノムの高変異性はreverse transcriptase(RT)に起因するとされているが、宿主側機構の関与も示唆されている。HIV-1が活性化B細胞に感染し得ること、HIV患者のBリンフォーマがプロウィルスを有することなどから、感染リンパ節の胚中心B細胞にはHIV-1が感染すると思われる。胚中心B細胞では、Ig遺伝子V領域およびbcl-6遺伝子に高率に突然変異が起こるが、HIV-1-LTRのエンハンサー特性から考えて、HIV-1プロウィルス遺伝子にも突然変異が誘導される可能性がある。この可能性を検証することが本研究の目的である。ヒトにおいてHIVゲノム変異がどこで起こったのかを解明することは困難である。従って、本研究ではトランスジェニックマウスおよびB細胞株をモデルとして、HIV-1プロウィルスが胚中心B細胞における突然変異誘導活性の標的となり得るかについて明らかにしたい。Ig遺伝子の突然変異は転写および特異的エンハンサーに依存しているので、HIV-1プロウィルスの突然変異に必要なシス配列はLTR領域であると考えられる。そこで、HIV-1-LTRとレポーター遺伝子とを連結したベクターを作製し、これをマウスや突然変異活性を有するB細胞株に導入し、レポーター遺伝子の変異を検出する。今年度はまずこのベクターを構築し、その発現を検証した。レポーターとして当初予定したGFPは蛍光強度が均一でないため、突然変異による発現低下のFACS解析が困難であった。そこで、細胞表面に均一に発現するヒトIL-4受容体α鎖遺伝子(IL-4Ra)をレポーター遺伝子とすることにした。HIV-LTRの下流にIL-4Raを連結したトランスジーンを作成した。陰性対照としてHIV-LTRの代わりにCMVのエンハンサー/プロモーターを用いたもの(CMV-IL-4Ra)、陽性対照として、CMV-IL-4Raの下流にIgL鎖遺伝子エンハンサーを連結したものを作成した。そして、これらがB細胞株で発現することを確認した。

HIV-1是导致艾滋病的病毒，其突变率很高，导致耐药性和逃避宿主的获得性免疫反应。 HIV-1 基因组的高度变异性据说是由逆转录酶 (RT) 引起的，但也有人认为宿主机制也参与其中。因为HIV-1可以感染活化的B细胞，并且因为HIV患者的B淋巴瘤含有原病毒，所以人们认为HIV-1感染受感染淋巴结中的生发中心B细胞。在生发中心B细胞中，Ig基因V区和bcl-6基因的突变发生率很高，但考虑到HIV-1-LTR的增强子特征，HIV-1原病毒基因也诱导有突变。有一种可能性本研究的目的就是验证这种可能性。很难确定人类中艾滋病毒基因组突变发生在哪里。因此，在本研究中，我们希望使用转基因小鼠和B细胞系作为模型来阐明HIV-1原病毒是否可以作为生发中心B细胞突变诱导活性的靶标。由于 Ig 基因的突变依赖于转录和特异性增强子，因此 HIV-1 原病毒突变所需的顺式序列很可能是 LTR 区域。因此，我们将创建一个连接HIV-1-LTR和报告基因的载体，将其引入具有突变活性的小鼠或B细胞系中，并检测报告基因的突变。今年，我们首先构建了这个载体并验证了其表达。最初用作报告基因的 GFP 荧光强度不均匀，使得 FACS 分析由于突变导致的表达下降变得困难。因此，我们决定使用细胞表面均匀表达的人IL-4受体α链基因（IL-4Ra）作为报告基因。创建了一个转基因，其中 IL-4Ra 连接到 HIV-LTR 的下游。作为阴性对照，使用CMV增强子/启动子(CMV-IL-4Ra)代替HIV-LTR，作为阳性对照，在CMV-IL-4Ra下游连接IgL链基因增强子。他们证实这些在 B 细胞系中表达。