CNR遺伝子クラスターから生じる分泌型遺伝子産物の探索と機能解析

CNR基因簇产生的分泌基因产物的搜索和功能分析

基本信息

批准号：
13035028
负责人：
濱田俊
金额：
$ 4.8万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

Cadherin-related Neuronal Receptor(CNR)ファミリーの遺伝子産物の多様性について、分泌型と思われる多様化したアイソフォームについて解析を行った。CNRv4(CNR1)の転写産物をreverse transcription-PCR法により増幅したところ、主要な膜結合型アイソフォームであるA型とB型以外にも多数の増幅産物が認められた。これらの産物について塩基配列決定とサザンブロット法による解析を行った結果、大部分が膜貫通領域を欠失したCNRv4のアイソフォームであることが明らかになった。また、ノーザンブロット法でも膜貫通領域近傍の配列を欠いた転写産物群の存在が示唆された。さらに、この様な転写産物は主に脳で検出され、脳以外の組織ではほとんど検出されなかった。また、得られたcDNAの幾つかをHEK293T細胞等に発現させたところ、一部のアイソフォームでは培養上清中に発現蛋白質が検出された。これら分泌型と想定されるアイソフォームが脳内に蛋白質として存在するかどうか検討するため、CNRv4アミノ末端部に対して作成した二種類の抗体を用いて免疫沈降法による検出を試みたが、微量であるためか、検出は困難であった。分泌型産物の大部分は第一カドヘリンドメインを有しており、膜結合型CNRと相互作用することが想定される。このため、その生理活性の検討には膜結合型CNRの機能を明らかにすることが必要であり、現在膜結合型CNRのなかでも主要なアイソフォームであるAおよびB型の遺伝子改変マウスを作成したので、表現型解析を行い、膜結合型の生理機能を明らかにしたいと考えている。

分析了似乎分泌的多种同工型，分析了cadherin相关神经元受体（CNR）家族中基因产物的多样性。当通过反转录PCR扩增CNRV4（CNR1）的转录本，除了主要膜结合的同工型A和B外，还发现了许多其他扩增产物。对Southern印迹的测序和对这些产物的分析表明，大多数是CNRV4是CNRV4同工型，缺乏跨膜区域。此外，北印迹还表明，存在一组跨膜区域附近序列的转录本。此外，此类转录本主要在大脑中检测到，而在大脑以外的组织中几乎没有检测到。此外，当某些获得的cDNA在HEK293T细胞中表达时，在某些同工型中在培养物上清液中检测到表达的蛋白质。为了研究这些应该分泌的同工型是否作为大脑中的蛋白质存在，我们试图通过使用在CNRV4的氨基末端产生的两种抗体进行免疫沉淀来检测它们，但是检测很困难，因为它们很小。大多数分泌产品具有主要的钙粘蛋白结构域，并设想与膜结合的CNR相互作用。因此，有必要澄清膜结合的CNR的功能，以研究其生理活性，并且由于我们创建了A和B的转基因小鼠，这些小鼠目前是膜结合CNR的主要同工型，因此我们希望进行表型分析以阐明膜结合CNR的物理功能。