シナプス形成におけるカドヘリン型受容体CNRファミリーの機能解析

钙粘蛋白型受体CNR家族在突触形成中的功能分析

基本信息

批准号：
12780564
负责人：
濱田俊
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

カドヘリン型受容体CNRは免疫系多様化受容体と類似の遺伝子クラスター構造を有するカドヘリンファミリーであり、その蛋白質はシナプスに存在することが示唆されている。本研究では1)CNR蛋白質の脳内での局在を明らかにすること、2)神経細胞培養系おけるCNR機能阻害抗体のシナプス形成に及ぼす影響を検討することを目的とした。(方法)昨年度までにCNR1アミノ末端部に対するポリクローナル抗体、CNR-AおよびCNR-B型抗体を得ていたが、さらに今年度はCNR1アミノ末端部に対するモノクローナル抗体4F11が得られた。4F11はイムノブロット法、免疫染色などで特異性が確認され、良好な染色結果が得られたため、この抗体を用いた蛍光抗体法によりマウス小脳発生過程におけるCNR蛋白質の発現・局在変化を検討した。また、静置界面培養法により、小脳スライス標本の培養を行い、CNR1-EC1ドメインを有する分泌型CNRを投与し、その効果を検討した。(結果・考察)イムノブロツト法によりCNR蛋白質の経時的発現変化を検討したところ、生後7〜14日目に発現量が最大となり、その後次第に減少することが明らかになった。この時期に免疫染色を行ったところ、形成されつつある分子層で強い免疫反応が観察された。小脳分子層でのシナプス形成はプルキンエ細胞層側から軟膜方向に向かい進行するが、CNRの発現はシナプス小胞蛋白質synaptophysinの発現よりもやや先行する領域で強く発現し、シナプス形成早期にCNR蛋白質が動員されることが示唆された。一方、静置界面培養法による小脳スライス培養にCNR1-EC1分泌型CNRを投与したが、スライス標本の品質が実験毎にばらつくため、定量的な結果を得ることが困難であることが判明し、より定量的なデータを得やすいと思われる分散培養法に変更して実験を行う予定である。

Cadhelin -type受体CNR是一种Cadhhelin家族，具有与免疫系统多样化受体相似的基因簇结构，这表明该蛋白质存在于突触中。在这项研究中，这项研究的目的是研究CNR蛋白位于大脑中的事实，以及2）CNR功能抗体的突触形成的作用，即可能是神经细胞培养系统。（方法）到去年，获得了CNR1氨基，CNR-A和CNR-B型抗体末端的多克隆抗体，但是今年获得了CNR1氨基末端的单克隆抗体4F11。由于4F11是特异性的，因此获得了良好的染色结果，因此通过使用此抗体检查了CNR蛋白在小鼠小脑生成过程中的表达和定位。此外，地下培养方法培养了小脑切片标本，管理具有CNR1-EC1域的分泌型CNR，并检查了效果。（结果 /考虑）通过IMNOBROTSUTO方法检查CNR蛋白的加班表达，据表明，该表达在出生后的第7至14天最大化，然后降低。此时，进行了免疫菌，并在形成的分子层中观察到强烈的免疫反应。小脑层中的突触形成从Pulkin细胞层发展到更柔和的方向，但是CNR的表达在比突触蛋白突触素的表达略有前面的区域中强烈表达，并且CNR蛋白在突触的早期是突触的早期建议动员。另一方面，通过持续的表面培养方法将CNR1-EC1分泌的CNR用于小脑切片，但发现很难获得定量结果，因为切片样品的质量在每个实验中都会有所不同通过更改为分布式培养方法进行，这可能是更定量的数据。