がん細胞におけるアポトーシスの分子解析

癌细胞凋亡的分子分析

基本信息

批准号：
12215156
负责人：
垣塚彰
金额：
$ 29.82万
依托单位：
Kyoto University (2001-2004)Osaka Bioscience Institute (2000)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞死・細胞増殖に関わる新規遺伝子・蛋白質として同定したAAA familyのATPaseであるVCP蛋白質について解析を行い、以下の諸点を明らかにした。(1)抗VCP抗体を用いて、正常組織及び各種癌組織でVCPの発現を解析した。マウス正常組織では、管腔構造をとる上皮系の細胞や免疫系細胞、乳腺上皮、胃酸合成細胞などの分泌系の細胞に強い発現を認めた。一方、ヒト癌由来の組織では、特に腺癌と扁平上皮癌に強い発現を認めた。(2)RNAi法を用いて、HeLa細胞で内在性のVCPを98%以上ノックダウンすることに成功した。このHeLa細胞では、紡錘体極の数が不安定になり、娘細胞に正しく染色体を分配することができなくなっていた。その結果、M期の終了後、細胞周期の停止もしくは細胞死に陥っていた。(3)VCP蛋白質内であるリン酸化を受けたアミノ酸を特異的に認識する抗体を作成し、培養細胞を免疫染色すると紡錘体極やセントロゾームが染色された。(4)外来性のVCPを誘導発現させることができる出芽酵母を作り、その酵母をEMSで処理してDNA変異を導入後、VCPの存在の有無で発育に差のでる温度感受性株を得た。その温度感受性株をゲノムライブラリーでトランスフォームし、温度感受性をレスキューする8つのゲノム断片を得た。(5)VCPをアセチル化する酵素の精製を進め、アセチル化活性のある分画に特異的と思われる蛋白質のバンドを数個にまで絞り込むことができた。

我们分析了AAA家族的ATPase VCP蛋白，该蛋白被鉴定为参与细胞死亡和细胞增殖的新型基因和蛋白质，并揭示了以下几点。（1）使用抗VCP抗体在正常组织和各种癌症组织中分析VCP的表达。在正常小鼠组织中，在具有腔内结构，免疫细胞，乳腺上皮和胃酸合成细胞的上皮细胞中观察到了强表达。另一方面，源自人类癌的组织特别容易发生腺癌和鳞状细胞癌。（2）使用RNAi方法，我们在HeLa细胞中成功地将内源性VCP击倒了98％以上。在此HeLa细胞中，主轴杆的数量变得不稳定，使得无法将染色体正确分配给子细胞。结果，在M期结束后，发生了细胞周期停滞或细胞死亡。（3）制备了特异性识别VCP蛋白质中磷酸化的氨基酸的抗体，并对培养的细胞进行免疫染色以染色纺锤杆和中心体。（4）产生糖酵母，可以诱导和表达外源VCP，并在用EMS处理酵母引入DNA突变后，根据存在或不存在VCP，获得了具有发育发育差异的温度敏感性菌株。用基因组文库转化温度敏感的应变，以获得八个挽救温度敏感的基因组片段。（5）进行乙酰酸VCP的酶的纯化，并且认为特定于具有乙酰化活性的馏分的蛋白质带的数量可以缩小到几种。