グルタミン酸トランスポータファミリーの基質透過とチャネル形成の分子機房の解明

阐明谷氨酸转运蛋白家族底物渗透和通道形成的分子机制

• 批准号: 09257242
• 负责人: 金井 好克
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257242/
• 关键词: トランスポータ; グルタミン酸; アミノ酸; グルタミン酸トランスポータ; 輸送; クローニング; キメラ解析

グルタミン酸トランスポータファミリーは、酸性アミノ酸のトランスポータ(グルタミン酸トランスポータ)と中性アミノ酸のトランスポータからなる、Na^+共役トランスポータのファミリーである。その有機基質及び無機イオンの認識部位の同定のために、以下の検討を行った。1)グルタミン酸トランスポータEAAC1とGLT-1の系統的キメラのシステイン輸送能の解析を行い、基質アミノ酸側鎖認識部位がジヒドロカイニン酸認識部位とは異なり、C-末側の長く伸長した疎水性領域中に存在することを明らかにした。2)中性アミノ酸トランスポータASCT1とASCT2の系統的キメラを作製し、グルタミン輸送の有無を指標に基質結合部位のマッピングを行い、アミノ酸側鎖認識部位がC-末側の疎水性領域中に存在することを明らかにした。これは、1)のグルタミン酸トランスポータで得られた結果と矛盾しないものである。さらに、キメラのLi^+受容性とNa^+濃度依存性を解析し、二つのN^+結合部位のうち少なくとも一つはアミノ酸側鎖認識部位の近傍に存在することを明らかにした。また、トランスポータの機能発現における蛋白質/蛋白質相互作用の研究の端緒を掴む目的で、3)グルタミン酸トランスポータGLT-1のspliced variantのクローニングとその共発現を行い、異なるC-末を持つvariant同志の共発現が輸送のVmaxの上昇をもたらすことを明らかにした。さらに、4)アミノ酸輸送活性化因子4F2hcと共役するアミノ酸トランスポータのcDNAを発現クローニング法によりクローニングし、トランスポータの機能発現における蛋白質/蛋白質相互作用について、新しい視点を提出した。

谷氨酸转运蛋白家族是Na+结合转运蛋白家族，由酸性氨基酸转运蛋白（谷氨酸转运蛋白）和中性氨基酸转运蛋白组成。为了确定有机底物和无机离子的识别位点，进行了以下研究。 1）我们分析了谷氨酸转运蛋白EAAC1和GLT-1的系统嵌合体的半胱氨酸转运能力，发现底物氨基酸侧链识别位点与二氢红藻氨酸识别位点不同，并且在其上具有较长的疏水区域C端一侧显示它存在于内部。 2）我们构建了中性氨基酸转运蛋白ASCT1和ASCT2的系统嵌合体，并以谷氨酰胺转运的存在与否为指标绘制了底物结合位点，发现氨基酸侧链识别位点位于C -末端疏水区宣布它会。这与 1) 中谷氨酸转运蛋白获得的结果一致。此外，我们分析了嵌合体的Li^+可接受性和Na^+浓度依赖性，发现两个N^+结合位点中至少有一个存在于氨基酸侧链识别位点附近。此外，为了掌握转运蛋白功能表达中蛋白质/蛋白质相互作用的研究开端，我们进行了3）谷氨酸转运蛋白GLT-1剪接变体的克隆和共表达，并鉴定了与研究表明，100% 的共表达导致运输 Vmax 的增加。此外，4)利用表达克隆方法克隆了与氨基酸转运激活剂4F2hc偶联的氨基酸转运蛋白的cDNA，并提出了转运蛋白功能表达中蛋白质/蛋白质相互作用的新视角。

项目成果

金井 好克: "分子医科学で病気を識るシリーズ5、チャネルとトランスポータその働きと病気:アミノ酸トランスポータとその異常による疾患" メジカルビュー社, 25 (1997)

Yoshikatsu Kanai：“用分子医学科学系列 5 了解疾病，通道和转运蛋白、其功能和疾病：氨基酸转运蛋白及其异常引起的疾病” Medical View Publishing，25 (1997)

Utsunomiya-Tate,N.: "Tissue specific variants of glutamato Transporter GLT-1." FEBS Letters. 416. 312-316 (1997)

Utsunomiya-Tate,N.：“谷氨酸转运蛋白 GLT-1 的组织特异性变体。”

Shayakul,C.: "Localization of the high-affinity glutamato transporter EAAC1 in rat kidney." Am.J.Physiol.(in press). (1998)

Shayakul,C.：“高亲和力谷氨酸转运蛋白 EAAC1 在大鼠肾脏中的定位。”

Kanai,Y.: "Family of neutral and acidic amino acid transporters:molecular biology,physlology and medical implications" Curr.Opin.Cell Biol.9. 565-572 (1997)

Kanai,Y.：“中性和酸性氨基酸转运蛋白家族：分子生物学、生理学和医学意义”Curr.Opin.Cell Biol.9。

金井 好克: "最新内科学大系プログレスシリーズ10 腎・:泌尿器疾患:アミノ酸トランスポータ" 中山書店, 9 (1997)

金井义胜：“最新内科进展系列10肾脏/泌尿系统疾病：氨基酸转运蛋白”中山书店，9（1997）