細胞周期関連遺伝子の導入による放射線抵抗性がんの感受性化機構

引入细胞周期相关基因对放射抗性癌症的增敏机制

基本信息

批准号：
09255227
负责人：
宮越順二
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09255227/
关键词：
細胞周期放射線感受性遺伝子導入 p16 IKBα アポトーシス

项目摘要

ヒト由来脳腫瘍細胞(T98、A1235)にp16cDNAを組み込んだ発現プラスミド(pOPMTS)をトランスフェクションし、G418にて選択し,T98から14個のクローン、A1235から20個のクローンを選んだ。これらのクローンからRNAおよびタンパクを抽出し、P16遺伝子の発現について、ノーザンおよびウエスタンプロットを用いて検索した。これらのクローンのうち、それぞれの細胞株からp16を発現している4クローンずつを実験に用いた。p16遺伝子導入により得られた計8つのクローンと親株(T98、A1235)およびベクター導入株(T-V4、A-V3)の放射線感受性を比較した場合、p16発現クローン全てにおいて、親株やベクター導入株に比べて放射線に感受性となった。対照のベクター導入株は親株と比較して放射線感受性に有意な差が見られなかった。フローサイトメトリーにより親株(A1235)、ベクター導入株(A-V3)およびp16遺伝子導入クローン(A-C29)に関してフローサイトメトリーにより指数的増殖期における細胞周期分布を調べたところ、細胞株間における有意な差は見られなかった。次に、放射線照射後の細胞周期分布について解析した。3Gy照射後20および40時間後におけるDNAヒストグラムの結果、全てのクローンにおいてG1アレストならびにG2ブロックが見られた。とくにp16発現クローン(A-C29)においてその効果は顕著であった。さらに、16発現クローンでは、放射線照射後、部分的なDNAのマイクロフラクションが観察された。このことは部分的なアポトーシスが起きていることを示唆している。ヒトI-κBα/MAD3cDNAを発現ベクターpcDNA3に組み込んでI-κBαの発現プラスミドの作製を完了した。放射線抵抗性脳腫瘍細胞(MO54ならびにA172)にI-κBα発現プラスミドをトランスフェクションし、選択培地によりI-κBα発現クローンをチェックした。得られたI-κBα過剰発現クローンの放射線感受性を検索したところ、用いた2種の脳腫瘍細胞からの複数クローンにおいて放射線感受性が高まっていた。また、放射線感受性化の程度は、I-κBα過剰発現の程度にほほ比例していた。親株ならびにI-κBα発現クローンを用いて5Gy放射線照射後のNF-κBのDNA結合活性をelectrophoretic mobility shift assayにて調べたところ、親株では核分画におけるDNA/NF-κB複合体の増加が観察され、I-κBα発現クローンではこの複合体に変化は見られなかった。従って、この結果は、I-κBα発現クローンにおいて放射線照射後、NF-κBの核移行が阻害されていることを示している。

用掺入p16 cDNA的表达质粒（POPMT）转染人类衍生的脑肿瘤细胞（T98，A1235），并用G418选择，用T98的14个克隆和来自A1235的20个克隆。从这些克隆中提取RNA和蛋白质，并使用北部和西部图搜索p16基因的表达。在这些克隆中，在实验中使用了来自每个细胞系的P16的四个克隆。当将母菌株（T98，A1235）和诱导矢量诱导菌株（T-V4，A-V3）的辐射敏感性与通过p16基因转移获得的八个克隆的总数比较所有表达p16的克隆对辐射的所有p16基因转移时，都比父母应变和载体诱导菌株更敏感。与母体菌株相比，对照载体引入菌株在辐射敏感性上没有显着差异。当通过流式细胞仪（A1235）的流式细胞仪检查指数生长阶段的细胞周期分布（A1235），载体转导菌株（A-V3）和P16转基因克隆（A-C29）时，细胞系之间未发现显着差异。接下来，分析辐射后的细胞周期分布。 3GY辐射后20和40小时DNA直方图显示在所有克隆中都发现了G1停滞和G2块。在表达p16的克隆（A-C29）中，效果特别明显。此外，在辐照后，在16个表达的克隆中观察到了部分DNA微裂缝。这表明正在发生部分凋亡。将人I-κBα/MAD3 cDNA掺入表达载体PCDNA3中，以完成I-κBα表达质粒的产生。用I-κBα表达质粒转染了耐药性脑肿瘤细胞（MO54和A172），并使用选择性培养基检查I-κBα表达克隆。当搜索获得的I-κBα过表达克隆以获得放射敏感性时，发现使用的两个脑肿瘤细胞的多个克隆被发现增加。此外，辐射敏感性程度与I-κBα过表达的程度成正比。当使用母体菌株和表达I-κBα表达克隆的5GY辐照后NF-κB的DNA结合活性通过电泳迁移率转移测定检查时，母体菌株显示出核分数中DNA/NF-κB复合物的增加，并且在表达I-κBα的Clone中没有观察到变化。因此，该结果表明在表达I-κBα的克隆中辐射后，NF-κB的核易位受到抑制。