C.elegans学習変異株の解析並びにニューロン機能解明

线虫学习突变体分析和神经元功能阐明

基本信息

批准号：
06256208
负责人：
細野隆次
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

シナプス伝達に関連し、presynapseに働く遺伝子を中心に解析を行っている。Presynapseでの情報伝達は、膜脱分極に伴う刺激伝導、神経終末でのCa^<++>の流入そしてシナプス小胞輸送に大別される。本研究では小胞輸送の解析を中心に行った。C.elegansではこれまで小胞輸送に働く遺伝子として、キネシン(unc-104)、アセチルコリン合成酵素(cha-1)、アセチルコリントランスポーター(unc-17)をコードする遺伝子等が明らかにされている。我々は、この過程に働くunc-18遺伝子を発見し、解析を行ってきた。unc-18がコードするタンパクは酵母のSEC1と似ていることから、unc-17より下流で、シナプス小胞が形質膜に結合、融合する過程に働くことが推定された。更に、unc-104,cha-1,unc-17のヌル変異が致死性であるのに対し、unc-18ヌル変異が致死でないことから、modulatoryな働きをしていることが推定された。そこでこの可能性を遺伝子発現と遺伝子産物の分子性状から検証した。UNC-18は分子量67,000で、荷重アミノ酸に富み分子全体が親水性であることから細胞質性可溶性タンパクであると推定された。実際、抗体を作成し、immunogoldによって、ventral nerve cordの神経軸索での局在を電顕観察したが特定組織への親和性はみられなかった。また昆虫Sf9細胞で過剰発現させると、UNC-18の大部分は細胞質に存在していた。次にC.elegansのシナプス小胞を精製し、その過程でのUNC-18はタンパクをWestern法で調べた。その結果、大部分は可溶性であるが、1部は小胞と親和性を持っていることが明らかになった。このタンパクは、cyclic AMP dependent protein kinase (PKA),casein kinase II (CKII)及びprotein kinase C (PKC)によるリン酸化モチーフを有していた。そこでin vitroでこれらの酵素によるリン酸化の可能性を探った。その結果PKCによってのみリン酸化された。リン酸化の程度は化学量論的でコントロールとして用いたHistone III-Sとほぼ同じで合った。リン酸化部位は4ケ所で、そのうち3ケ所は哺乳類でも保持されていた。こうしたことから、リン酸化は生理的役割を担っていると推定された。この遺伝子は神経系に特異的に発現する。この発現はATG上流1kb以内に存在することが明らかになった。更にdeletion analysisを行い、ATGからおよそ400bp上流の100bpDNA断片にシスエレメントが存在していた。現在その中の最小領域の決定と結合して発現をするトランス因子の同定を行っている。最近UNC-18の哺乳類でのホモログ(n-Sec1/Munc-18)が分離され、神経終末形質膜にあるシンタキシンと相互作用していることが明らかにされた。UNC-18とC.elegansシンタキシンとの相互作用を知る目的で、degenerate PCRにより、神経系特異的シンタキシンAのhomologを単離した。このクローンを用い、広汎なcDNAライブラリースクリーニングを行いおよそ60cDNAクローンを分離した。塩基配列からそれらは3つのクローンからなることが明らかになった。推定されるアミノ酸配列から、これは何れもC末側が形質膜にアンカーとして結合し、3ケ所の他のタンパクと相互作用していると推定されるamphipathic領域が存在していた。UNC-18とシンタキシンとの相互作用を知るため、GAL4転写活性を利用したYeast two hybrid systemを採用した。各cloneをtransformationすると、GAL4活性が観察され、相互作用していることが確認された。

我们正在进行分析，重点是与突触传递有关的非逐渐发挥作用的基因。循道前的信息传播可以大致分为与膜去极化，Ca^<++>在神经末端的涌入和突触囊泡转运相关的刺激传导。这项研究的重点是分析囊泡运输。秀丽隐杆线虫先前已经揭示了在囊泡转运中起作用的基因，例如编码驱动蛋白（UNC-104），乙酰胆碱合酶（CHA-1）和乙酰胆碱转运蛋白（UNC-17）的基因。我们发现并分析了在此过程中起作用的UNC-18基因。由UNC-18编码的蛋白质与酵母SEC1相似，据估计，突触囊泡在结合和融合与UNC-17下游的质膜结合和融合过程中起作用。此外，据估计，UNC-104，CHA-1和UNC-17的无效突变是致命的，而UNC-18无效突变不是致命的，因此估计它们具有调节功能。因此，基于基因产物的基因表达和分子特性来验证这种可能性。 UNC-18的分子量为67,000，富含负载的氨基酸，是亲水性的，使其成为细胞质可溶性蛋白。实际上，产生了抗体，并使用免疫元素通过电子显微镜观察到腹神经绳的定位，但观察到对特定组织的亲和力没有观察到。同样，当在昆虫SF9细胞中过表达时，在细胞质中发现了大多数UNC-18。然后纯化秀丽隐杆线虫的突触囊泡，并通过西方方法检查了在此过程中UNC-18的蛋白质。结果表明，尽管大多数是可溶的，但一个部分与囊泡具有亲和力。该蛋白质具有循环AMP依赖性蛋白激酶（PKA），酪蛋白激酶II（CKII）和蛋白激酶C（PKC）的磷酸化基序。因此，我们探讨了这些酶在体外磷酸化的可能性。结果，仅通过PKC将其磷酸化。磷酸化的程度与用作对照的组蛋白III-S相似。有四个磷酸化位点，其中三个也保留在哺乳动物中。这表明磷酸化起着生理作用。该基因在神经系统中特别表达。发现该表达在ATG上游的1 kb之内。此外，进行了缺失分析，并且在100 bp的DNA片段中存在顺式元素，大约400 bp的ATG上游。当前，我们正在确定与确定其中最小区域并表达的反式因子。最近，已分离出UNC-18（N-SEC1/MUNC-18）的哺乳动物同源物，并已显示与神经末端质膜中的义话相互作用。为了了解UNC-18和秀丽隐杆线虫语法之间的相互作用，通过简并PCR分离了神经系统特异性语法A的同源物。该克隆被用来通过广泛的cDNA库筛选来分离大约60个cDNA克隆。核苷酸序列表明它们由三个克隆组成。从推导的氨基酸序列中，有一个两亲性区域被假定与质膜结合为锚固，并与其他三种蛋白质相互作用。为了了解UNC-18与义话之间的相互作用，我们采用了利用GAL4转录活性的酵母两种混合系统。每个克隆的转化显示GAL4活性，并确认其相互作用。