線虫アセチルコリン異常蓄積変異遺伝子unc-18の構造と機能

线虫乙酰胆碱异常积累突变基因unc-18的结构与功能

• 批准号: 05780609
• 负责人: 安藤 恵子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780609/
• 关键词: 線虫C.elegans; アセチルコリン異常蓄積; 神経伝達物質放出; unc-18遺伝子; シナプス; 線虫C.elegans; アセチルコリン異常蓄積; 神経伝達物質放出; unc-18遺伝子; シナプス

本研究はシナプスにおける情報伝達機構解明を目的とする。線虫C.elegansのunc-18遺伝子は68Kの親水性蛋白質をコードし、unc-18遺伝子変異により、行動異常、アセチルコリンエステラーゼ抵抗性、アセチルコリン異常蓄積等の表現型がみられる。また、酵母の細胞内小胞輸送に関与するSecl/Slyl/Slplとの類似性から、UNC-18蛋白質は神経伝達物質放出に関わる新しい因子であると推論された。特に変異によりsecretory vesicleの蓄積を起こすseclと似ていることから、神経細胞においてsynaptic vesicleの神経終末への輸送やexocytosisに関与している可能性が考えられた。unc-18の発現パターンを抗UNC-18抗体による免疫染色で調べたところ、腹部神経索を構成する運動神経細胞の細胞体と軸索が強く染色され、頭部ガングリオンの一部のん神経細胞でも特異的に発現が認められた。unc-18遺伝子変異はアセチルコリン異常蓄積を引き起こすが、コリン作働性神経細胞だけではなく、セロトニン作働性、GABA 作働性神経細胞でも発現していることから、一般的な神経伝達物質放出に関与することが示唆される。また、本年度の研究実施計画に基づき、UNC-18蛋白質の機能ドメインを同定するため線虫C.elegansの近縁種C.briggsaeのゲノムライブラリーを作製し、unc-18相同遺伝子をクローニングした。DNA塩基配列から予測されるアミノ酸配列は高度に保存されており(97.5%同一)、C.elegansUNC-18蛋白質に対する抗血清と交叉反応を示した。線虫のシナプス機能に関与する遺伝子には哺乳動物遺伝子と相同性を示すものがあることから、マウスunc-18相同遺伝子のクローニングを行った。弱い条件下でのサザン、ノーザンハイブリダイゼーションによりシグナルが検出されなかったため、Secl/Slyl/Slplとの相同領域をプライマーとして脳PolyA+RNAのRT-PCRを行った。unc-18とアミノ酸レベルで70%程度相同な2つの分子種が得られた。これら2つのマウス相同遺伝子と2つの線虫遺伝子のコードするアミノ酸配列を比較することにより、高度に保存された配列が決定された。また、マウス相同遺伝子のノーザンブロット解析から、一方は脳特異的な4.0kbの転写産物がみられ、他方は各組織に2.8kbの転写産物が検出された。この結果はunc-18相同遺伝子がシナプスにおけるregulated secretionだけでなく真核細胞共通に起こるconstitutive secretionにも関与することを示唆する。現在、これらの相同遺伝子が線虫unc-18突然変異を機能相補し得るかどうか検討中である。

这项研究旨在阐明突触中信息传输的机制。线虫C.秀丽隐杆线虫中的UNC-18基因编码68K亲水性蛋白，而UNC-18基因的突变导致表型，例如行为异常，乙酰胆碱酯酶耐药性和乙酰胆碱异常的积累。此外，据推断，UNC-18蛋白是从与Secl/slyl/Slpl相似的神经递质释放中涉及的新因素，该因素与酵母中细胞内囊泡转运有关。特别是，它类似于Secl，它导致由于突变引起的分泌囊泡积累，并且认为它可能参与突触囊泡向神经末端的运输和神经元中的胞吐作用。当通过用抗UNC-18抗体进行免疫染色来检查UNC-18的表达模式时，对组成腹神经索的运动神经元的细胞体和轴突进行了强染色，并且在头部神经节中的某些癌神经元中也观察到了特异性表达。 UNC-18基因突变会引起异常的乙酰胆碱的积累，但不仅在胆碱能神经元中表达，而且在产生5-羟色胺的神经元中也表明，这表明它参与了一般神经递质的释放。此外，根据今年的研究实施计划，制备了秀丽隐杆线虫的近亲C. briggsae的基因组文库，并将UNC-18同源基因克隆起来，以识别UNC UNC-18蛋白的功能结构域。从DNA碱基序列预测的氨基酸序列高度保守（97.5％相同），并与抗甲状腺梭状芽胞杆菌-18蛋白显示出与抗血清的交叉反应。在线虫中参与突触功能的一些基因与哺乳动物基因具有同源性，因此将小鼠UNC-18同源基因克隆。由于在弱条件下没有通过南部和北部杂交检测到信号，因此使用与secl/slyl/slpl同源的区域作为引物进行了脑polya+RNA的RT-PCR。获得了两种分子物种，在氨基酸水平上与UNC-18的氨基酸水平约为70％。通过比较这两个小鼠同源基因与两个线虫基因编码的氨基酸序列来确定高度保守的序列。此外，小鼠同源基因的北印迹分析表明，一个显示脑特异性4.0 kb转录本，另一个显示每个组织中的2.8 kb转录本。该结果表明，UNC-18同源基因不仅参与了突触的调节分泌物，而且还参与了真核细胞中通常发生的本构分泌。目前，我们正在研究这些同源基因是否可以在功能上补充线虫UNC-18突变。