シナプスにおけるインパルス伝達にかかわる遺伝子の系統的同定と分子性状の解明

突触脉冲传递相关基因的系统鉴定和分子表征

基本信息

批准号：
03225209
负责人：
細野隆次
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではシナプスにおけるインパルス伝達にかかわる遺伝子を同定し,その分子性状を解明する目的で出発し,ほぼその目的を達することができた。アセチルコリン伝達にかかわる遺伝子,unc‐18をクロ-ニングし,発現系ペクタ-に組み込み融合タンパクを作成した。これを用いて常法により抗体を作製し,得られた抗体を用い,Westcrn blottingによりタンパクの生化学的性状を調べた。このタンパクは分子量およそ68,000で,転写産物と一致して幼虫初期に多くの発現が見られた。また突然変異体では全く発現が認められなかった。次に免疫組織化学により遺伝子産物の組織内分布を調べた。その結果運動ニュ-ロン軸索に特に多く,アセチルコリンの異常蓄積との関連性が示唆された。次に遺伝子産物を合成する細胞を同定するため,β‐galactosidaseをreporterとするcxpression vectorに挿入し,C.elegansにmicroinjectionしてその発現を見た。その結果motorneuronにのみ発現していることが判明した。したがって,この遺伝子は,運動ニュ-ロン細胞体で発現し,その神経突起に分布していることから,なんらかのかたちでアセチルコリンの挙動にかかわっていることが示唆された。以上のようにunc‐18遺伝子産物はコリン作動性ニュ-ロンに働いていると考えられる。このことを遺伝学的方法で検討した。ace‐3はclass C acetylcholinesteraseをコ-ドしている。この遺伝子を欠くと,acetylcholinesterase阻害剤に対し高感受性となる。この性質を利用し,unc‐18ace‐3二重変異を作成し,感受性を調べたところ依然高感受性を示した。したがってunc‐18の働きはace‐3とは独立で,コリン作動性ニュ-ロン固有ではないことが分かった。

在这项研究中，我们开始鉴定突触中涉及脉冲传播的基因，并阐明它们的分子特性，并且我们能够实现这一目标。克隆了参与乙酰胆碱传递的基因，以在表达系统petor中产生整合的融合蛋白。使用这种方法，通过常规方法制备抗体，并使用所获得的抗体使用WestCRN印迹检查蛋白质的生化特性。该蛋白的分子量约为68,000，在早期幼虫中高度表达，与转录本一致。此外，在突变体中未观察到表达。接下来，通过免疫组织化学检查了基因产物的组织分布。结果表明它在运动神经元轴突中尤其常见，这表明它与乙酰胆碱的异常积累有关。接下来，为了鉴定合成基因产物的细胞，将细胞插入以β-半乳糖苷酶作为报告基因的cxpression载体中，并将其显微注射到秀丽隐杆线虫中以观察其表达。结果，发现它仅在motorneuron中表达。因此，该基因在食肉细胞体中表达并分布在其神经突中，表明它以某种方式参与了乙酰胆碱的行为。如上所述，UNC-18基因产物被认为作用于胆碱能神经元。使用遗传学方法对此进行了检查。 ACE-3代码C类C乙酰胆碱酯酶。缺乏该基因使其对乙酰胆碱酯酶抑制剂高度敏感。使用此属性，创建了UNC-18ACE-3双突变并检查了灵敏度，并且仍然非常敏感。因此，发现UNC-18的功能与ACE-3无关，并且对胆碱能神经元不是固有的。