cGMP系の血管平滑筋細胞分化決定における新しい意義に関する分子医学的研究

cGMP系统决定血管平滑肌细胞分化新意义的分子医学研究

基本信息

批准号：
09281219
负责人：
伊藤裕
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

これまで我々は、ナトリウム利尿ペプチドがcGMP系を活性化しvascular growthに対して抑制的に作用することを明らかにした。更に、ナトリウム利尿ペプチドの一つであるCNPが血管内皮細胞において生合成されることを明らかにし、CNPがNOと並ぶペプチド性のEDRFであることを証明し、“血管壁ナトリウム利尿ペプチド系"という概念を提唱した。最近、CNP遺伝子組み換えアデノウイルスを構築し、培養血管平滑筋細胞にCNP遺伝子を導入し過剰発現させることでcGMP系を活性化すると、増殖がGl期で停止するとともに、再分化が生ずるという新しいcGMP系の作用を報告した。更に、心血管系特異的ホメオボックス遺伝子であるGaxがcGMP系の活性化によりその遺伝子発現が亢進することも報告し、cGMP系において転写因子Gaxという新しいシグナル伝達経路が存在する可能性を提示した。本年度は、cGMPカスケードにおいてcGMP産生よりGax発現亢進に至るシグナル伝達経路を明らかにするため、我々が既にクローニングに成功したヒトcGMP依存性プロティンキナーゼ(Gキナーゼ)タイプIαについて検討した。すなわち、GキナーゼのN端部の二重化ドメイン、cGMP結合ドメインを欠失させたミュータントを作成し、βアクチンプロモーター、サイトメガロウィルスエンハンサーを有する発現ベクターを構築した。Gキナーゼ特異的基質を用いたin vitroのGキナーゼkination assayを確立し、このミュータントGキナーゼがcGMPを必要としない持続活性型constitutive activeであることを明らかにした。更に、このミュータントGキナーゼ発現ベクターを用い、培養血管平滑筋細胞の遊走、増殖が著明に抑制されることを明らかにし、cGMPカスケードによる血管平滑筋細胞のフェノタイプ決定におけるGキナーゼの関与を証明した。更に、CNP-cGMP-Gキナーゼ-Gaxに至る血管平滑筋分化決定におけるシグナル伝達経路においてcyclin/CDK complexの抑制因子であるp21^<CIPl>の関与を明らかにした。

到目前为止，我们已经表明亚位肽肽激活CGMP系统并在血管生长上行动。此外，据透露，CNP是纳地尿肽之一，是在血管内皮细胞中生物合成的，并证明CNP是一种肽样的EDRF，并提出了“血管壁纳入纳替肽系统”的概念。最近，我们报道了新的CGMP系统的效果是，当构建CNP遗传修饰的腺病毒并通过将CNP基因转染到培养的血管平滑肌细胞中并过表达CNP基因时，CGMP系统被激活时，在GLEN和REDIDEDIREDIRIDICINID中会停止增殖。此外，我们报道说，GAX是一种心血管特异性同源基因，通过激活CGMP系统增强，这表明CGMP系统中存在称为转录因子GAX的新型信号通路。今年，我们研究了人类CGMP依赖性蛋白激酶（G激酶）Iα型，我们已经成功克隆了它，以澄清信号传导途径，从而导致CGMP级联中CGMP产生的GAX表达增加。也就是说，创建了突变体，其中删除了G激酶的N末端部分的加倍结构域和CGMP结合域，并构建了具有β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子的表达载体。我们使用G激酶特异性底物建立了体外G激酶Kination测定法，表明该突变型G激酶是一种连续的活性本构活性活性，不需要CGMP。此外，使用这种突变的G激酶表达载体，我们揭示了培养的血管平滑肌细胞的迁移和增殖得到了显着抑制，这证明了G激酶在确定CGMP级联的血管平滑肌细胞表型中的参与。此外，我们揭示了Cyclin/cdk复合物的抑制剂P21^<cipl>在确定血管平滑肌分化与CNP-CGMP-G激酶-GAX的信号传导途径中的参与。