霊長類ES細胞由来血管前駆細胞を用いた新しい血管発生分化誘導ホルモン探索法の開発

开发利用灵长类 ES 细胞来源的血管祖细胞寻找诱导血管发育和分化的激素的新方法

基本信息

批准号：
14657264
负责人：
伊藤裕
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657264/
关键词：
ES細胞 VEGF 血管ホルモン内皮細胞血管平滑筋細胞前駆細胞

项目摘要

我々はこれまで、血管ホルモンに着目しその血管リモデリングにおける意義に関して一貫して研究を続けてきた。一方、最近になり我々はマウスES細胞より内皮細胞と血管平滑筋細胞の双方への分化が可能な、まさに"血管先駆細胞(幹細胞)"と呼びうる細胞の単離同定に成功した。すなわち、我々は血管新生因子であるVEGFの受容体であるFlk1陽性細胞より、内皮細胞、壁細胞(血管平滑筋細胞及びペリサイト)の双方が分化することを発見した。本研究は、霊長類ES細胞を用いたin vitro血管発生分化システムを駆使して、創薬につながる新規血管再生液性因子(血管ホルモン)の網羅的探索を目的とした。すなわち、これまで我国においてほとんど取り扱われなかった霊長類ES細胞を用いて、それらの細胞をレポーター細胞として構築し、新たな血管再生ホルモンのクローニング法を開発することを目指した。本研究課題により、以下の研究成果を得た。カニクイザルES細胞を用い、Flk-1発現動態及び内皮細胞及び血管平滑筋細胞の分化について、マウスES細胞と比較して検討した。マウスES細胞では、未分化なES細胞はFlk-1を発現していないが、コラーゲンIVコートディッシュ上で4日間分化誘導を行うと30〜40%がFlk-1陽性となる。一方、サルES細胞はマウスES細胞と異なり、未分化な状態で既に大部分の細胞がFlk-1を発現していた。しかし、これらの未分化ES細胞に含まれるFlk-1陽性細胞は、血管前駆細胞としての働きを持たなかった。マウス頭蓋冠由来のフィーダー細胞との共培養にて分化誘導を試みたところ、一度Flk-1陽性分画がほぼ消失したのち、8日後に再び8%がFlk-1陽性でかつ内皮マーカーVEカドヘリン陰性となった。これらの細胞は未分化ES細胞が持つアルカリフォスファターゼ活性を持たず、Flk-1陽性の未分化ES細胞とは異なるものであった。このFlk-1陽性VEカドヘリン陰性細胞をFACSにて分離し、再培養したところ、VEカドヘリン陽性PECAM1陽性eNOS陽性の内皮細胞及びα平滑筋アクチン陽性カルポニン陽性の壁細胞が出現し、それらはコラーゲンゲルによる3次元培養にて血管様構造を構築した。以上、我々は霊長類ES細胞における血管前駆細胞の分化誘導とその性状の把握に成功した。更に我々は、マウスFlk-1遺伝子5'領域-640/+299の部位及び3'イントロン部位(+1677/+3947)をGFP発現遺伝子に組み込んだベクター(8.5kb)を構築し、これをマウスES細胞に導入発現する系を確立した。また、ES細胞と共培養することにより、Flk-1陽性VPCの分化を誘導することのできるマウスストローマ細胞株OP-9よりcDNAライブラリーを構築した。今後、同定したサルES細胞由来血管前駆細胞を用いたGFP発現系を確立し、OP-9cDNAライブラリーより新規血管発生分化誘導ホルモンを探索する予定である。

我们一直在研究血管重塑的重要性，重点是血管激素。另一方面，我们最近能够分离和鉴定可以称为“血管前体细胞（干细胞）”的细胞，这些细胞可以从小鼠ES细胞分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞。换句话说，我们发现内皮细胞和顶叶细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）都不同于FLK1阳性细胞，FLK1阳性细胞是血管生成因子VEGF的受体。这项研究旨在全面探索新型的血运流体因子（血管激素），这些因子通过使用灵长类动物ES细胞利用体外血管分化系统，从而导致药物发现。换句话说，我们的目的是使用在日本很少处理的灵长类动物ES细胞，并将这些细胞构建为记者细胞，并开发一种新方法来克隆血运激素。该研究主题已得到如下：使用小鼠ES细胞相比，使用cynomolgus猴子ES细胞来检查FLK-1表达的动力学以及内皮和血管平滑肌细胞的分化。在小鼠ES细胞中，未分化的ES细胞不会表达FLK-1，但是胶原蛋白IV涂层菜肴的分化诱导的30-40％为FLK-1阳性4天。另一方面，与鼠ES细胞不同，猴子ES细胞已经在未分化的状态下表达FLK-1。然而，这些未分化的ES细胞中包含的FLK-1阳性细胞不能充当血管祖细胞。当尝试与源自小鼠瓦尔瓦里亚的馈线细胞共同培养中诱导分化时，FLK-1阳性分数几乎消失了一次，在8天后，8％的flk-1阳性为阳性，内皮标记物ve cadherin nater。这些细胞没有未分化的ES细胞所具有的碱性磷酸酶活性，并且与FLK-1阳性未分化的ES细胞不同。通过FACS分离FLK-1阳性VE-钙粘蛋白阴性细胞，并重新培养，并用VE-钙粘蛋白阳性PECAM1阳性eNOS阳性阳性内皮细胞和α-平滑肌肌动蛋白 - 肌动蛋白 - 肌动蛋白 - 肌动蛋白阳性钙蛋白阳性细胞出现了类似于熟料的结构，并构建了孔均熟悉[3ddded cruptions in Cruption in Cruption of Fincrancy of Fincrancy of Floge。因此，我们成功地诱导了灵长类动物ES细胞中血管祖细胞的分化并掌握了其特性。此外，我们构建了一个载体（8.5 kb），其中小鼠FLK-1基因5'区域-640/+299和3'内含子位点（+1677/+3947）的位点集成到GFP表达基因中，并建立了一种用于传输小鼠ES细胞的系统。此外，由小鼠基质细胞系OP-9构建了cDNA文库，该cDNA文库可以通过与ES细胞共培养来诱导FLK-1阳性VPC的分化。将来，我们计划使用鉴定出的猴子ES细胞衍生的血管祖细胞建立GFP表达系统，并从OP-9 cDNA库中搜索新的血管分化诱导激素。