ヒトMTH1蛋白質の発現制御と突然変異抑制機能の解析

人MTH1蛋白表达调控及突变抑制功能分析

基本信息

批准号：
09269222
负责人：
中別府雄作
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)MTH1遺伝子とその転写産物の構造:我々は、ヒト培養細胞株から調整したMTH1 mRNAの5'末端領域をcDNAとして増幅し、その塩基配列とゲノム遺伝子の塩基配列の比較解析から、ヒトMTH1遺伝子は、5つの主なエクソンからなり、エクソン1が1aと1b、エクソン2が2a、2b、2cの3つのセグメントからなり、これらの択一的スプライシングにより7種類のmRNA(Type 1、2A、2B、3A、3B、4A、4B)をコードすることを明らかにした。Type1 mRNAは、最も発現量が多いMTH1遺伝子の転写物であるが、エクソン2を完全に欠損し、エクソン1aから直接エクソン3へのスプライシングを受けていた。2つのタイプのMTH1 mRNA(Type2A、2B)は、エクソン1aにそれぞれエクソン2bあるいは2b-2cが連結していた。Type3のmRNAはエクソン1bにエクソン2b(Type 3A)、あるいは2b-2c(Type 3B)が連結していた。Type4の2つのmRNAには、エクソン1の配列がなく、それぞれエクソン2a-2b(Type4A)、あるいはエクソン2a-2b-2c(Type4B)から始まっていた。さらに、健常人ボランテイアの末梢血リンパ球と胸腺から調整したMTH1 mRNAの解析からヒト臓器でもこれらの7つのMTH1 mRNAが発現していることを確認した。健常人ボランテイアの一人は、4つのタイプ(Type 1、2B、3B、4B)のMTH1 mRNAのみ発現していたが、その配列とゲノム遺伝子配列の解析から、エクソン2の2b-2c間の5'スプライシング部位(GTGA)の配列が(GCGA)に置換されており、2b-2c間でスプライシングがおこらず、2b-2cが必ず連結したMTH1 mRNAのみが生じることが明らかになった。複数の健常人ボランテイアから樹立したリンパ球細胞株のゲノム配列の解析から、このT→Cの塩基置換は遺伝的多型性の1つであることが明かになり、その存在比は約4:1であった。(2)MTH1蛋白質の構造と発現:4つのMTH1 mRNA(Type 1、2A、3A、4A)には共通の開始コドン(ATG4)から始まる1つの翻訳フレームが存在し、18kDaのMTH1ポリペプチドをコードすることが予測された。一方、エクソン2b-2cのセグメントが連続して存在する3種類のmRNA(2B、3B、4B)の5'-領域にはin frameで新たな翻訳開始コドンが3つ(ATG1〜3)上流に存在する。エクソン2b-2c間の5'スプライシング部位が(GTGA)の場合、このTGAがin frameのストップコドンとなるため3つの開始コドン(ATG2〜4)が機能することが予測され、(GCGA)の場合、4つの開始コドンが(ATG1〜4)全て機能する可能性が示唆された。また、それぞれのmRNAのin vitro翻訳で対応するポリペプチド(18、19,5、20、22,5kDa)が翻訳されることと、それぞれのATG配列をATCに置換することにより対応する翻訳産物が消失することから、1つのタイプのmRNAから択一的な翻訳開始が起こることが期待された。複数のボランテイアから樹立したリンパ球細胞株のウエスタンブロッテイングの解析から、エクソン2b-2c間の5'スプライシング部位の遺伝的多型性に一致して3つのあるいは4つのMTH1ポリペプチドが検出された。

(1)MTH1基因及其转录本的结构：我们将人培养细胞系制备的MTH1 mRNA的5'端区域扩增为cDNA，通过其碱基序列与基因组基因的碱基序列对比分析，我们发现人类MTH1基因由5个主要外显子组成，外显子1由1a和1b组成，外显子2由3个片段2a、2b和2c组成，通过这些片段的选择性剪接，产生7种类型的mRNA（Type）。 1、2A、2B、3A、3B、4A、4B）。 1型mRNA是MTH1基因表达最高的转录本，但它完全缺乏外显子2，并经历从外显子1a到外显子3的直接剪接。两种类型的 MTH1 mRNA（2A 型和 2B 型）分别具有与外显子 1a 连接的外显子 2b 或 2b-2c。 3 型 mRNA 的外显子 2b（3A 型）或 2b-2c（3B 型）与外显子 1b 连接。两种 4 型 mRNA 缺少外显子 1 序列，并分别从外显子 2a-2b（4A 型）或外显子 2a-2b-2c（4B 型）开始。此外，对健康志愿者外周血淋巴细胞和胸腺制备的MTH1 mRNA的分析证实，这7种MTH1 mRNA也在人体器官中表达。其中一名健康志愿者仅表达四种类型的MTH1 mRNA（1型、2B型、3B型和4B型），对MTH1 mRNA序列和基因组基因序列的分析显示，外显子2的2b和2c之间的5'被表达。 MTH1中，剪接位点(GTGA)序列被(GCGA)取代，2b和2c之间不发生剪接，2b和2c始终连接。很明显，只产生了 mRNA。对多个健康志愿者建立的淋巴细胞系的基因组序列分析发现，这种T→C碱基取代是一种遗传多态性，丰度比约为4：1。 (2)MTH1蛋白的结构和表达：四种MTH1 mRNA(1型、2A型、3A型、4A型)具有从共同起始密码子(ATG4)开始的一个翻译框，其编码18kDa MTH1多肽。另一方面，在外显子2b-2c片段连续存在的三种mRNA(2B、3B和4B)的5'区中，三个新的翻译起始密码子(ATG1至3)位于读框上游。。如果外显子2b和2c之间的5'剪接位点是(GTGA)，则该TGA成为框内终止密码子，因此预测三个起始密码子(ATG2至4)起作用，并且在(GCGA)的情况下，它有人建议所有四个起始密码子（ATG1-4）可能都有功能。此外，每个mRNA的体外翻译导致相应的多肽（18,19,5,20,22,5kDa）被翻译，并且通过用ATC替换每个ATG序列，产生相应的翻译产物。消失后，预计一种类型的 mRNA 会发生替代翻译起始。对多个志愿者建立的淋巴细胞系进行蛋白质印迹分析，检测到三个或四个 MTH1 多肽，与外显子 2b 和 2c 之间 5' 剪接位点的遗传多态性一致。