活性酸素による神経細胞死とその防御機構の解析

活性氧引起的神经细胞死亡及其防御机制分析

基本信息

批准号：
10176226
负责人：
中別府雄作
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はこれまで活性酸素による酸化障害の対象として遺伝子の本体であるDNAに注目し、その酸化障害の化学的実体の解明と障害に対する防御機構の解明を進めてきた。この研究の過程で、活性酸素はDNAと直接反応してその切断や塩基の酸化(8-オキソグアニンの生成等)をひき起こすだけでなく、DNAの前駆体であるデオキシリボヌクレオシド三リン酸を直接酸化する事を明らかにした。dGTPの酸化体の1つである8-oxo-dGTPは、DNAの複製に際して鋳型DNA上のアデニンに対して取り込まれ誤った塩基対合を形成するため遺伝情報の正確な伝達と発現を妨げる。GTPの酸化体である8-oxo-GTPも同様に生じるが、これは遺伝子の転写の際に誤ってUTPの代りにRNAに取り込まれ、遺伝情報の正確な発現を妨害する。我々は、このような核酸の酸化障害に対する生物の防御機構について研究を進め、(1)ヌクレオチドプール中の8-oxo-dGTPを分解、排除する酵素(ヒト:MTH1蛋白質)と、(2)ゲノムDNA中に存在する8-オキソグアニンの除去修復酵素(ヒト:OGG1蛋白質)が、大腸菌からヒトまで普遍的に存在することを明らかにした。ヒトOGG1 mRNAには択一的スプライシングにより2つのタイプ(タイプ1、2)が存在することが知られている。今回我々は、RT-PCRによりヒトOGG1 mRNAの構造を解析し、タイプ1はさらに2つのサブタイプに(1a、1b)、タイプ2は5つのサブタイプ(2a、2b、2c、2d、2e)に分かれる事を明らかにした。このうちJurkat細胞では、それぞれタイプ1aと2aの発現レベルが最も高かった。各mRNAがコードする7つのヒトOGG1蛋白質は、N末端側の190アミノ酸残基を共有し、それぞれユニークなC末端領域を持つ。タイプ2a蛋白質のC末端領域を認識する抗体を用い、ヒト細胞のミトコンドリア分画をウエスタンブロッティングで解析したところ、40.5kDaの蛋白質が検出された。ミトコンドリア固定切片をこの抗体と金コロイド標識プロテインAと反応後、電子顕微鏡で観察したところ、その内膜に金コロイドのシグナルが検出された。組み換え蛋白質の発現実験から、タイプ2a蛋白質はそのN末端のミトコンドリア移行シグナルとC末端領域に依存してミトコンドリアに移行することが明らかになった。一方タイプ1a蛋白質は、そのC末端領域に存在する核移行シグナルに依存して核に局在する。種々のヒト組織におけるOGG1mRNA量をノーザンブロッテイングおよびRT-PCRで定量したところ、OGG1mRNAのレベルは脳組織において最も高く、かつタイプ1a、2aがメインであった。このことは、脳・神経細胞においては核やミトコンドリアDNA中にの8-オキソグアニンが効率良く修復されていることを示唆する。

我们着眼于作为活性氧引起的氧化损伤的靶标的基因主体DNA，致力于阐明氧化损伤的化学物质和针对该损伤的防御机制。在这项研究过程中，活性氧不仅直接与DNA发生反应，导致其碱基裂解和氧化（例如产生8-氧代鸟嘌呤），而且还直接破坏DNA的前体脱氧核糖核苷三磷酸。氧化。 8-oxo-dGTP是dGTP的氧化形式之一，在DNA复制过程中掺入模板DNA上的腺嘌呤，形成错误的碱基配对，从而干扰遗传信息的准确传递和表达。 8-oxo-GTP（GTP的氧化形式）也会出现，但在基因转录过程中它被错误地掺入RNA而不是UTP，干扰遗传信息的正确表达。我们正在研究生物体抵御此类核酸氧化损伤的防御机制，并已鉴定出 (1) 一种酶（人类：MTH1 蛋白），可降解并消除核苷酸库中的 8-oxo-dGTP，以及 (2 ）一种分解和消除 8-oxo-dGTP 的全基因组酶据揭示，DNA 中存在的 8-oxoguanine 去除和修复酶（人类：OGG1 蛋白）从大肠杆菌到人类普遍存在。众所周知，由于选择性剪接，人类 OGG1 mRNA 存在两种类型（1 型和 2 型）。在这里，我们通过RT-PCR分析了人类OGG1 mRNA的结构，发现1型进一步分为两个亚型（1a，1b），2型进一步分为5个亚型（2a，2b，2c，2d， 2e) 宣布将分为其中，1a 型和 2a 型在 Jurkat 细胞中的表达水平分别最高。每个 mRNA 编码的 7 个人类 OGG1 蛋白在 N 端共享 190 个氨基酸残基，并且每个蛋白都有一个独特的 C 端区域。当使用识别 2a 型蛋白 C 末端区域的抗体通过蛋白质印迹分析人类细胞的线粒体部分时，检测到了 40.5kDa 的蛋白。当固定的线粒体切片与该抗体和胶体金标记的蛋白A反应并在电子显微镜下观察时，在内膜中检测到胶体金信号。重组蛋白的表达实验表明，2a 型蛋白根据其 N 端线粒体易位信号和 C 端区域易位到线粒体中。另一方面，1a 型蛋白根据其 C 末端区域中存在的核定位信号定位到细胞核。通过Northern blotting和RT-PCR对人体各组织中OGG1 mRNA的量进行定量时发现，脑组织中OGG1 mRNA的水平最高，且以1a型和2a型为主。这表明细胞核和线粒体 DNA 中的 8-氧代鸟嘌呤在大脑和神经细胞中得到了有效修复。