基本転写因子の機能と転写制御機構

转录因子的基本功能和转录控制机制

• 批准号: 05273205
• 负责人: 北嶋 繁孝
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05273205/
• 关键词: 基本転写因子TFIIF; 転写開始; mRNA伸長; リン酸化; PolII結合; ハイブリッドIIF; DBPolF複合体; 基本転写因子TFIIF; 転写開始; mRNA伸長; リン酸化; PolII結合; ハイブリッドIIF; DBPolF複合体

我々は、これまでにヒト基本転写因子TFIIFのcDNAクローニングによる一次構造の解析、更にはdeletion mutantを用いたTFIIF活性ドメインの解析を行なってきた(Yonaha et al.NAR 21:273-279,1993)。当該年度において、次の点を明かにした。HeLa TFIIFをin vitroでアルカリフォスファターゼ処理すると、RAP74は、SDS-PAGE上、大腸菌で発現させたRAP74(r74)と同じsizeになり、RAP30には変化がなかった。この脱リン酸化型のIIFは、in vitro転写活性およびmRNA伸長促進活性が低下しており、これは、RNA polymeraseIIとの結合活性が低下するためであった。TFIIFは、large subunit(RAP74)とsmall subunit(RAP30)とからなるheteromerであるため、どちらのsubunitの脱リン酸化がこれらの効果をもたらすかを,nativeなサブユニットとrecombinantなサブユニットとをもちいて、それぞれ等モルの条件でハイブリットIIFを作製することで解析した。その転写開始活性は、nativeどうしのハイブリットが最も高い活性を示し、recombinant IIFは10-20%の低い活性であった。一方、nativeとrecombinantとのハイブリットであるn30/r74は、recombinant IIFと同レベルの低い活性であったが、r30/n74の組み合わせでは、native IIFに匹敵する効率良い活性が再構成された。また、minimal promoter sequenceと、TBP,IIB,IIF,PolIIで形成される転写開始複合体(DBPolF複合体)をnative gel electrophoresisで測定したところ、脱リン酸化IIFは、その形成能を低下させること、ハイブリットIIFのうちr30/n74は、n30/n74に相当する活性を示すがn30/r74はrIIF同様の低い活性しか示さなかった。これらの結果はsuboptimalな量のIIFで認められ、saturateした量では差がなかった。以上のことから、非修飾型IIFは、転写開始、mRNA伸長促進、DBPolF複合体形成の活性をもつが、その強さは、翻訳後修飾によって制御されることがわかった。特に、RAP74のリン酸化は、TFIIF活性をup-regulateすることがわかった。一方、RAP30はin vivoでリン酸化されているが、その意義については明かにできていない。しかしながら、rIIFも、飽和量を用いると十分なDBPolFをつくることから、RAP30のPolII結合にはその修飾は必須でないと考えられた(Kitajima,S.et al.manuscript in preparation.)。

到目前为止，我们已经通过cDNA克隆分析了人类基本转录因子TFIIF的主要结构，并使用缺失突变体分析了TFIIF活性结构域（Yonaha等人21：273-279，1993）。以下几点在财政年度揭示。当在体外用碱性磷酸酶处理HELA TFIIF时，Rap74的大小与在SDS-PAGE上大肠杆菌中表达的Rap74（R74）相同，Rap30没有变化。这种去磷酸化的IIF形式减少了体外转录活性和mRNA伸长促进活性，这是因为其与RNA聚合酶II的结合活性降低了。由于TFIIF是由大型亚基（RAP74）和小亚基（RAP30）组成的异构体，因此对确定哪种亚基去磷酸化的分析可通过使用天然和重组亚基和等效层状条件下创建杂交IIF来产生这些影响。他们的转录起始活性是天然杂种的最高活性，重组IIF的活性较低10-20％。另一方面，N30/R74是天然和重组的混合体，具有与重组IIF相似的活性水平，但是R30/N74的组合重构了与天然IIF相当的有效活性。此外，当通过最小启动子序列和TBP形成的转录启动复合物（DBPOLF络合物（DBPOLF复合物））通过天然凝胶电泳测量的IIB，IIF和POLII测量时，DephosperyLated IIF降低了其形成能力，降低了其hybrid IIF，R30/N74的活性等效于N30/N30/N30/N30/N30/N30/N30/N30/N330，但里夫。观察到这些结果的IIF量低，饱和量没有差异。从以上发现，未修饰的IIF具有启动转录，促进mRNA伸长和形成DBPOLF复合物的活性，但其强度受到翻译后修饰的控制。特别是，发现Rap74的磷酸化上调TFIIF活性。同时，Rap30在体内被磷酸化，但尚未揭示其意义。但是，RIIF还使用饱和度量产生足够的DBPOLF，因此，人们认为其与Rap30结合并不需要进行修饰（Kitajima，S。等人的手稿制备中的手稿）。