GABAシナプスにおけるカルシウム結合蛋白、レセプター及びトランスポーターの解析

GABA 突触中钙结合蛋白、受体和转运蛋白的分析

基本信息

批准号：
04267219
负责人：
小坂俊夫
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04267219/
关键词：
GABA カルシウム結合蛋白 Purkinje cell 小脳免疫細胞化学定量解析

项目摘要

神経細胞内でのカルシウム結合蛋白parvalbuminPVの局在を明らかにするため小脳のPurkinje細胞をモデルとして選び、コロイド金(直径15nm)標識二次抗体を用いた、いわゆるコロイド金免疫電顕を行なった。直接倍率1万倍で撮影し、写真上でPurkinje細胞及び他の細胞の各部位を同定し、単位面積(1mm^2)当たりのコロイド金粒子数を測定した。コロイド金免疫電顕におけるコロイド金密度と抗原密度との相関について調べる目的で、既知量のPVを含有している標準試料を作製した。ラットの筋肉からHPLCを用いてPVを精製し、牛血清アルブミンに一定量の精製PVを溶解し、固定液(グルタールアルデヒド)を混合して固定した。固定した標準試料は脳組識と全く同様の方法でLowicry1樹脂包理し、電顕レベルでの包理後免疫細胞化学を行なった。コロイド金密度(粒子数/μm^2)は細胞体及び樹状突起で15-20、軸索及び軸索終末50-60であり、明らかに細胞内におけるPVの濃度差があった。速筋であるm.gastronemiusでは生化学的解析により細胞内のPV濃度が300-550μMと推定されるがコロイド金免疫電顕でのコロイド金密度をPV標準試料のCalibration curveで検討したところ筋内PV濃度は400μMであると推定された。このことからPV標準試料のCalibration curveが一般の生物試料に適用できることが明らかになった。これに基づいてPV濃度を細胞体樹状突起では50-100μM、軸索及び終末部では1-2mMであろうと推定した。PVは小脳Purkinje細胞内分布での解析から、ニューロンの出力部である軸索及び軸索終末により高濃度存在していることが示唆された。このことはPVの発現が発生的にはニューロンの成熟と平行して増加してくることも含めて、その機能を考える上で重要な意味を有していると思われる。

为了阐明钙结合蛋白parvalbuminPV在神经元内的定位，选择小脑中的浦肯野细胞作为模型，并使用胶体金（直径15nm）标记的二抗进行所谓的胶体金免疫电子显微镜检查。直接放大10000倍拍摄照片，在照片上识别浦肯野细胞和其他细胞，并测量单位面积（1mm^2）的胶体金颗粒数量。为了研究胶体金免疫电镜中胶体金密度与抗原密度之间的相关性，制备了含有已知量PV的标准样品。使用HPLC从大鼠肌肉中纯化PV，将一定量的纯化PV溶解于牛血清白蛋白中，并通过与固定剂（戊二醛）混合来固定。将固定后的标准样品按照与脑组织完全相同的方式包埋在Lowicry1树脂中，包埋后进行电镜水平的免疫细胞化学分析。细胞体和树突中的胶体金密度（颗粒数/μm^2）为15-20，轴突和轴突末端为50-60，细胞内PV浓度存在明显差异。在快肌肌中，通过生化分析估计细胞内 PV 浓度为 300-550 μM，但当使用胶体金免疫电子技术使用 PV 标准样品的校准曲线检查胶体金密度时显微镜检查发现，肌内PV浓度为300-550μM，PV浓度估计为400μM。这表明PV标准样品的校准曲线可以适用于一般生物样品。据此，我们估计细胞体和树突中的PV浓度为50-100μM，轴突和终末中的PV浓度为1-2mM。对小脑浦肯野细胞中PV分布的分析表明，轴突和轴突末端是神经元的输出部分，存在高浓度的PV。当考虑 PV 的功能时，这似乎具有重要意义，包括 PV 表达与神经元成熟同时增加的事实。