カルシウム結合蛋白質を介するリソソーム膜の損傷応答機構の分子基盤解明

阐明钙结合蛋白介导的溶酶体膜损伤反应机制的分子基础

基本信息

批准号：
22H02302
负责人：
柴田秀樹
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02302/
关键词：
リソソームカルシウム結合蛋白質 ESCRT カルシウム

项目摘要

リソソームは細胞内消化を担う膜で覆われた細胞小器官である。限界膜が損傷したリソソームからは、加水分解酵素や水素イオン、カルシウムイオンなどが漏出する。研究代表者らは、損傷したリソソームにカルシウム結合蛋白質ALG-2が動員される現象を見出しており、リソソームの損傷を誘発した細胞においてALG-2の近傍に存在する蛋白質を同定している。本年度は、その中でLIP5に着目し以下を解析した。(1) LIP5の免疫染色実験により、LIP5がリソソーム損傷を誘導した細胞でリソソームに動員されることを観察した。LIP5のリソソーム動員におけるカルシウムイオンの役割を明らかにする目的で、カルシウムキレータであるBAPTA-AMを処理したところ、LIP5のリソソーム動員が抑制された。一方、ALG-2のノックアウト細胞でもリソソーム損傷刺激後のLIP5のリソソーム局在が観察された。(2) LIP5の発現抑制がその相互作用蛋白質であるVPS4A/Bの損傷リソソームへの局在に与える影響を解析した。VPS4A/Bはリソソーム損傷刺激を加えた細胞においてリソソームに局在したが、LIP5を発現抑制するとリソソーム局在が観察されなかった。(3)LIP5発現抑制細胞のリソソーム損傷刺激後の細胞死誘導に関して、ウエスタンブロット解析により発現抑制していない細胞と比較した。その結果、LIP5の発現抑制細胞はリソソーム損傷刺激後にカスパーゼ3/7の基質蛋白質の切断断片が多く検出され、アポトーシスが誘導されていると考えられた。

溶酶体是负责细胞内消化的膜覆盖的细胞器。水解酶，氢离子，钙离子等。从裂解膜受损的溶酶体泄漏。研究人员发现，钙结合蛋白ALG-2被募集到受损的溶酶体中，并鉴定出在诱导溶酶体损伤的细胞中ALG-2附近存在的蛋白质。今年，我们专注于LIP5，并分析了以下内容：（1）在LIP5的免疫染色实验中，我们观察到LIP5被募集到诱导溶酶体损伤的细胞中的溶酶体。为了阐明钙离子在LIP5溶酶体募集中的作用，用钙螯合剂Bapta-AM治疗lip5的溶酶体募集。另一方面，在ALG-2基因敲除细胞中也观察到溶酶体损伤后的LIP5的溶酶体定位。（2）我们分析了抑制LIP5表达对其相互作用蛋白VPS4A/B的定位对受损溶酶体的抑制作用。 VPS4A/B位于受溶酶体损伤的细胞中的溶酶体，但是当抑制LIP5时，未观察到溶酶体定位。（3）关于刺激溶酶体损伤后脂肪5表达细胞的细胞死亡诱导，将蛋白质印迹分析与未表达抑制的细胞进行了比较。结果，人们认为在LIP5表达抑制细胞中刺激溶酶体损伤后，检测到胱天蛋白酶3/7的底物蛋白的许多切割片段，从而导致凋亡。