ミトコンドリアユビキチン修飾シグナルのシステム解明

线粒体泛素修饰信号系统的阐明

基本信息

批准号：
22K20637
负责人：
伊藤直樹
金额：
$ 1.83万
依托单位：
Gakushuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

MITOLによるユビキチン修飾の生理的役割の解明として、新規基質HMOX2の修飾について解析を行った。脱ユビキチン化アッセイの結果、MITOLによってHMOX2へ付加されるポリユビキチン鎖はプロテアソーム分解に働くK48結合型ではなく、活性制御に働くK63結合型であった。また、HMOX2におけるユビキチン化されるリジン残基を同定するべく、26箇所全てのリジンを1箇所ずつアルギニンに置換した変異体を作製し、各変異体の修飾を検討した。その結果、MITOLによるユビキチン化が顕著に減少する変異体を見出した。MITOLの基質に対するユビキチン鎖決定機構の解明として、新規結合分子OTUD4について解析を行った。OTUD4は通常K48結合型のユビキチン鎖を切断するが、リン酸化されることでK63結合型を切断するようになるユニークな脱ユビキチン化酵素である。以前より所属の研究室にて解析を進めてきたParkinは、MITOLによってCCCP刺激時にK48結合型、Rotenone刺激時にK63結合型のユビキチン鎖が付加される。同様の刺激条件下において、OTUD4のリン酸化をPhos-tag PAGEにより検出したところ、CCCP刺激時にのみリン酸化されることを見出した。したがって、Parkinのユビキチン鎖の種類はMITOLではなく、OTUD4によって決定されていることが示唆された。MITOLのユビキチン化基質の新規スクリーニング法の構築のために、AID2システムを導入したHeLa細胞を樹立した。OsTIR1安定発現細胞においてCRISPR-Cas9法を用い、ゲノム上のMITOL遺伝子のエキソン１領域にmAIDタグ配列をノックインした。5-Ph-IAA処理後、3時間以内に内在性MITOLが消失することをウエスタンブロッティングにより確認できた。

为了阐明 MITOL 修饰泛素的生理作用，我们分析了新型底物 HMOX2 的修饰。去泛素化实验结果显示，MITOL 添加到 HMOX2 上的多聚泛素链不是作用于蛋白酶体降解的 K48 连接型，而是作用于活性调节的 K63 连接型。此外，为了鉴定HMOX2中泛素化的赖氨酸残基，我们创建了突变体，其中所有26个赖氨酸一次一个被精氨酸取代，并检查了每个突变体的修饰。结果，我们发现了一种突变体，其中 MITOL 的泛素化显着降低。为了阐明 MITOL 底物泛素链测定的机制，我们分析了新型结合分子 OTUD4。 OTUD4 是一种独特的去泛素酶，通常会裂解 K48 连接的泛素链，但当磷酸化时，它会裂解 K63 连接的泛素链。我的实验室已经对 Parkin 进行了一段时间的分析，当用 CCCP 刺激时，MITOL 会添加 K48 连接的泛素链，而当用鱼藤酮刺激时，会添加 K63 连接的泛素链。当在相似的刺激条件下通过Phos-tag PAGE检测OTUD4的磷酸化时，发现它仅在CCCP刺激下才被磷酸化。因此，有人认为Parkin泛素链的类型是由OTUD4而不是MITOL决定的。为了构建一种新的 MITOL 泛素化底物筛选方法，我们建立了转染 AID2 系统的 HeLa 细胞。在稳定表达 OsTIR1 的细胞中，使用 CRISPR-Cas9 方法将 mAID 标签序列敲入基因组 MITOL 基因的外显子 1 区域。 Western blotting证实内源性MITOL在5-Ph-IAA处理后3小时内消失。