Ntn-hydrolaseファミリーを標的とする新しい阻害剤の基本分子構造の開発-γ-Glutamyltranspeptidaseをテストケースとした阻害剤設計-

开发针对 Ntn 水解酶家族的新型抑制剂的基本分子结构 - 使用 γ-谷氨酰转肽酶作为测试案例的抑制剂设计 -

• 批准号: 14658188
• 负责人: 平竹 潤
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658188/
• 关键词: Ntn-hydrolase; γ-グルタミルトランスペプチダーゼ; ホスホン酸モノフェニルエステル; 機構依存的酵素阻害剤; ブレンステッドプロット; acceptor site-directed modulator

本研究は、酵素のN末端にある求核性のアミノ酸残基(Ser, ThrおよびCys)を活性中心し、N-terminal nucleophile hydrolase(Ntn-hydrolase)ファミリーと呼ばれる特徴的な一群のペプチド加水分解酵素について、その反応機構および構造上の特徴を足がかりに、本酵素ファミリーに特異的な阻害剤の新しい基本構造を開発することを目的としたものである。そこで、典型的なNtn-hydrolaseの一員である、γ-glutamyltranspeptidase(GGT)を用いて、遷移状態アナログ阻害剤となるホスホン酸誘導体を合成した。すなわち、基質であるグルタミン酸γアミドの加水分解の遷移状態を想定し、γカルボキシ基がホスホン酸基で置換された骨格(2-amino-4-phosphonobutanoic acid)をもとに、リン酸モノフェニルエステル、および、p-位に電子吸引性の置換基X(CF_3,Ac,CN)をもつ一連のリン酸モノ(p-置換フェニル)エステルを合成した。これらの化合物は求電子的なリン原子を有し、酵素自身のもつ触媒作用により、GGTの触媒残基(N末端求核性残基)と反応し、安定な共有結合を形成することによって、GGTを不可逆的に失活させる強い阻害活性が見られた(mechanism-based enzyme inactivation)。酵素の失活の二次反応速度定数(k_<on>)を測定したところ、k_<on>=0.26(X=H),190(CF_3),1344(Ac)および2700(CN)M^<-1>sec^<-1>となり、酵素の失活速度から見積もった阻害剤の強さは、電子吸引性の置換基をもつモノフェニルホスホン酸エステルほど大きいことがわかった。すなわち、酵素と阻害剤との反応速度は、脱離基(p-置換フェノール)の脱離能に大きく依存していた。そこで、酵素の失活速度k_<on>の対数を、脱離基である置換フェノールのpK_aに対してプロットしたところ(Broensted plot)、傾き-2の良好な直線関係が得られた(β_<lg>=-2)。このことから、酵素と阻害剤との反応はlate transition stateの反応であり、置換フェノールの脱離過程が重要であることがわかった。また、阻害剤による失活速度による違いが、γ-グルタミル受容サイトにリガンドが結合することにより引き起こされる酵素の活性化と関連していることが示唆された。

这项研究重点关注称为 N 端亲核水解酶 (Ntn-Hydrolase) 家族的特征基团的肽水解，该家族主要关注酶 N 端的亲核氨基酸残基（Ser、Thr 和 Cys）。本研究的目的是根据酶的反应机制和结构特征，开发针对该酶家族的抑制剂的新基本结构。因此，我们使用γ-谷氨酰转肽酶（GGT）（一种典型的Ntn水解酶）来合成作为过渡态类似物抑制剂的膦酸衍生物。即，假定底物谷氨酸γ酰胺水解的过渡态，以γ羧基被膦酸基取代的骨架（2-氨基-4-膦酰基丁酸）为基础，制备磷酸单苯酯。 ，并合成了一系列对位带有吸电子取代基X（CF_3，Ac，CN）的磷酸单（对位取代苯基）酯。这些化合物具有亲电子磷原子，通过酶本身的催化作用与GGT的催化残基（N端亲核残基）反应，形成稳定的共价键，观察到不可逆地失活GGT（机制-）。基于酶失活）。测定酶灭活二级反应速率常数（k_<on>）时，k_<on>=0.26（X=H）、190（CF_3）、1344（Ac）和2700（CN）M^< - 1>sec^-1>，表明由酶失活速率估计的抑制剂强度对于具有吸电子取代基的单苯基膦酸酯来说更大。也就是说，酶和抑制剂之间的反应速率很大程度上取决于离去基团（对位取代苯酚）的离去能力。因此，当我们将酶失活率 k_<on> 与作为离去基团的取代苯酚的 pK_a 作图（布朗斯特德图）时，得到了斜率为 -2 的良好线性关系（β_< lg >=-2)。由此发现，酶与抑制剂之间的反应是后期过渡态反应，取代苯酚的消除过程很重要。也有人提出，抑制剂引起的失活速率的差异与配体与γ-谷氨酰受体位点结合引起的酶活化有关。

项目成果

J.Hiratake, H.Suzuki, H.Kumagai: "Handbook of Proteolytic Enzymes, 2^<nd> Edition"Academic Press(In press). (2003)

J.Hiratake、H.Suzuki、H.Kumagai：“蛋白水解酶手册，第 2 版”学术出版社（正在印刷中）。