インドール酢酸(IAA)複合体の生合成・分解を化学的にノッアウトする

化学敲除吲哚乙酸 (IAA) 复合物的生物合成和降解

• 批准号: 17651124
• 负责人: 平竹 潤
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17651124/
• 关键词: インドール酢酸; アミノ酸複合体; IAA-aa合成酵素; IAA-aa加水分解酵素; アデニル化中間体; 中間体アナログ阻害剤; ホスフィン酸遷移状態アナログ; 化学的ノックアウト

本研究は、オーキシン(インドール酢酸、IAA)のホメオスタシスに重要な役割を果たしていると思われる、インドール酢酸-アミノ酸複合体(IAA-aa)の合成酵素および加水分解酵素の特異的阻害剤を設計・合成し、遺伝子ノックアウトの代わりに、阻害剤によって化学的に酵素活性をノックアウトするような化合物を開発することを目的としたものである。オーキシン早期誘導遺伝子のGH3ファミリーの一群が、IAA-aa合成酵素ではないかとの予測をふまえ、その推定反応機構にもとづき、IAAのアデニル化中間体のアナログとして、IAAのスルファモイルアデノシン誘導体(IAA-SA)を合成した。さらに、天然および人工オーキシンであるフェニル酢酸、ナフタレン-1-酢酸、2,4-DそれぞれのSA誘導体(PA-SA,NAA-SA,2,4-D-SA)を合成した。得られた化合物は、大腸菌で発現させたGH3-5およびGH3-6に対する阻害活性を測定した。その結果、いずれの化合物も、GH3-5およびGH3-6を両方とも阻害する強い活性を示し、特に、PA-SAはIC_<50>値にして3μM以下の強い阻害活性を示した。これら一連のSA誘導体を培地に溶かし、シロイヌナズナの幼植物体を培養したところ、2,4-D-SAが1μMの低濃度で、根の著しい形態変化を引き起こすことがわかった。これは、IAA過剰時に見られる異常発根(adventitious rooting)に酷似しており、化合物が植物体に取り込まれ、GH-3を阻害することによってオーキシンのホメオスタシスに影響を与えている可能性が強く示唆された。一方、IAA-aa加水分解酵素についての知見はきわめて乏しいが、IAA-aa添加によってIAA過剰症が出ない変異体の解析から、IAR3,ILR1,ILL2などの遺伝子が見いだされ、それが金属プロテアーゼの一種であるとの知見をもとに、アミノ酸部分の構造の異なるIAAホスフィン酸誘導体5種類を合成した。ホスフィン酸誘導体は、濃度依存的にILR1を阻害することが判明し、合成した化合物が、少なくとも、IAA-aa加水分解酵素の障害剤として機能することが確かめられた。以上のように、酵素の推定反応機構を唯一の手がかりに、反応機構依存的に設計したオーキシンのSA誘導体および、IAAホスフィン酸誘導体が、予想通り、IAA-aa合成酵素および加水分解酵素の阻害剤として機能し、特に、SA誘導体はin vivoでも活性を示す、化学ノックアウト剤として有望な化合物であることがわかった。

本研究旨在设计和开发吲哚乙酸-氨基酸复合物（IAA-aa）合酶和水解酶的特异性抑制剂，这些抑制剂被认为在生长素（吲哚乙酸，IAA）的稳态中发挥重要作用。并开发使用抑制剂而不是基因敲除来化学敲除酶活性的化合物。基于一组早期生长素诱导基因GH3家族可能是IAA-aa合酶的预测，并基于推测的反应机制，我们开发了IAA的氨磺酰腺苷衍生物（IAA）作为IAA腺苷酸化中间体的类似物.-SA)被合成。此外，合成了天然和人工生长素苯乙酸、萘-1-乙酸和2,4-D的SA衍生物（PA-SA、NAA-SA、2,4-D-SA）。测量所得化合物对大肠杆菌中表达的GH3-5和GH3-6的抑制活性。结果，所有化合物对GH3-5和GH3-6均显示出强抑制活性，特别是PA-SA显示出强抑制活性，IC_ 50 值为3μM或更小。当将一系列SA衍生物溶解在培养基中并培养拟南芥幼苗时，发现2,4-D-SA在1μM的低浓度下引起根部显着的形态变化。这与 IAA 过量时出现的不定根非常相似，并且该化合物很可能被植物吸收并通过抑制 GH-3 影响生长素稳态。另一方面，虽然对IAA-aa水解酶的了解甚少，但通过分析因添加IAA-aa而不会表现出高IAA症状的突变体，发现了IAR3、ILR1和ILL2等基因，并且这些基因负责产生金属蛋白酶，基于这是一种IAA次膦酸衍生物的知识，我们合成了五种具有不同氨基酸部分结构的IAA次膦酸衍生物。发现次膦酸衍生物以浓度依赖性方式抑制ILR1，并证实合成的化合物至少起到IAA-aa水解酶抑制剂的作用。如上所述，以推测的酶的反应机理为唯一线索，以反应机理依赖性方式设计的生长素的SA衍生物和IAA次膦酸衍生物被发现是IAA-aa合酶和水解酶的抑制剂。特别是，SA衍生物被发现是作为化学敲除剂的有前途的化合物，甚至在体内也显示出活性。