培養肺胞上皮細胞気管内注入による肺病変修復促進に関する分子生物学的検索

气管内注射培养肺泡上皮细胞促进肺部病变修复的分子生物学研究

• 批准号: 14657394
• 负责人: 須加原 一博
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657394/
• 关键词: 急性肺傷害; 創傷治癒; サイトカイン; 肺胞上皮細胞; 培養細胞; 骨髄幹細胞; 分子生物学

1.培養肺胞II型上皮細胞気管内投与による投与(培養)細胞の動態-これまでの研究成果から、(1)近交系ラット間の方が細胞生着率が良い(投与細胞の20〜30%)。(2)細胞外マトリックと培養細胞の相互作用が培養細胞機能保持に重要(Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍細胞の細胞外マトリックスがよい)。(3)4-diamino-phenylindole(DAPI)やlipophilic dialkylcarbocyanines(Dil or DiD)を用いて、投与細胞と組織細胞の区別が可能であること、(4)細胞増殖因子であるKGFで、12時間培養細胞を刺激して気管内投与すると、両方の細胞に増殖反応がみられ、投与細胞の約30%が生着すること、(5)KGF投与後2〜3日目に最大増殖能(BrdU取り込み最大)を示し、イオン輸送能もそれとよく相関することなどが明らかになった。2.呼吸不全動物肺での培養細胞気管内投与-エンドトキシン、ブレオマイシンや塩酸による肺障害ラットについて、KGF刺激培養肺胞II型上皮細胞を気管内投与し、その投与細胞の動態と肺病変の変化を検索した。障害肺に肺水腫様変化が強いために、投与細胞が肺胞レベルまで到達しにくく、生着率が悪い。そのため、障害後2〜3日目に人工サーファクタントを投与してみた。少し生着率が高くなった。最適な投与方法や時期について検討し、5〜7日目に投与すると効果大。3.KGFおよび人工サーファクタントの併用効果-上記障害ラット肺について、KGFと人工サーファクタントを同時に投与し、肺水腫液の吸収度を検索すると、吸収促進が示唆された。この方法を応用し研究を進めている。4.骨髄幹細胞からのlung stem cellsの分離と病変修復への応用-ラットに5-FUを投与し、骨髄を刺激し、骨髄細胞を採取。培養し血球成分を除いた骨髄幹細胞をBrdUラベルし、静脈投与。肺胞への生着度を検索。ブレオマイシン肺傷害への生着度を比較検討し、傷害肺への生着が高いことがわかった。これらがKGFに反応するか検索中。反応する場合は、病変修復作用があるか検索を計画している。さらに、GFP(green-fluorescence protein)ラットを使用予定。5.FGF-10およびFGF-18による障害抑制-FGF-10およびFGF-18が新たな肺胞II型上皮細胞増殖因子として作用するため、KGFとの相乗効果などについて検索するとともに、細胞増殖による障害抑制効果についても検索を進めている。6.HGFベクターを用いた障害抑制-培養細胞、正常ラット肺および呼吸不全動物肺へのHGFベクターの気管内投与の効果について検索中で、培養細胞への移入率、呼吸不全動物肺での移入率など明らかにする予定である。

1.气管内给药（培养）的培养肺泡II型上皮细胞的动态 - 根据迄今为止的研究结果，（1）近交系大鼠中细胞植入率更好（给药细胞的20%~30%）。 (2)细胞外基质与培养细胞之间的相互作用对于维持培养细胞功能很重要（优选Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的细胞外基质）。 (3) 4-二氨基苯基吲哚 (DAPI) 和亲脂性二烷基碳花青 (Dil 或(4)当用细胞生长因子KGF刺激培养的细胞12小时并气管内施用时，两种细胞均表现出增殖反应，显然，约30%的施用细胞存活，(5)最大增殖能力。 (最大BrdU摄取)在KGF施用后2至3天显示，并且离子转运能力与此密切相关。 2.将培养细胞气管内给予呼吸衰竭动物的肺部——将KGF刺激的培养的肺泡II型上皮细胞气管内给予内毒素、博来霉素或盐酸导致肺损伤的大鼠，并观察其动态变化。所搜索的施用细胞和肺部病变的变化。由于受损肺部出现强烈的肺水肿样变化，施用的细胞很难到达肺泡水平，导致植入率较差。因此，我们尝试在受伤后2至3天给予人工表面活性剂。存活率略高。考虑最佳的给药方式和时间，第5～7天给药效果最佳。 3.KGF和人工表面活性剂联合使用的效果-当将KGF和人工表面活性剂同时给予上述受损大鼠肺并检查肺水肿液的吸收程度时，表明吸收增强。我们目前正在应用这种方法进行研究。 4.从骨髓干细胞中分离肺干细胞并应用于病变修复——给予大鼠5-FU刺激骨髓并收集骨髓细胞。将培养的骨髓干细胞（已去除血细胞成分）用 BrdU 标记并静脉注射。寻找肺泡的植入程度。博莱霉素植入受损肺部的比较研究表明，受损肺部的植入率很高。我目前正在寻找这些是否对 KGF 有反应。如果有反应，我们计划研究它是否具有损伤修复作用。此外，我们计划使用 GFP（绿色荧光蛋白）大鼠。 5.FGF-10和FGF-18对损伤的抑制 - 由于FGF-10和FGF-18作为新的肺泡II型上皮细胞生长因子，我们将寻找与KGF等的协同作用。我们也在进行研究因其抑制残疾的作用。 6. 使用HGF载体抑制损伤 - 我们目前正在研究气管内施用HGF载体对培养细胞、正常大鼠肺和呼吸衰竭动物肺的影响，我们计划揭示其比率和其他细节。

项目成果

T.Oshiro, K.Sugahara, et al.: "Antenatal treatment with vitamin A reduces the incidence of nitrofen-induced congenital diaphragmatic hernia but decreases lung growth"Am J Respir Crit Care Med. 167(in press). (2003)

T.Oshiro、K.Sugahara 等人：“用维生素 A 进行产前治疗可降低除草醚诱发的先天性膈疝的发生率，但会降低肺部生长”Am J Respir Crit Care Med。

K.Sugahara, et al.: "The roles of alveolar type II epithelial cells in inflammation and repair process of acute lung injury"J Jpn Med Soc Biol Interface. 33. 5-9 (2002)

K.Sugahara等：“肺泡II型上皮细胞在急性肺损伤炎症和修复过程中的作用”J Jpn Med Soc Biol Interface。

S.Nakamura, K.Sugahara, et al.: "Effect of GABA agents on morphine induced spastic paraparesis after a non-injurious interval of spinal cord ischemia in rats"Anesthesia & Analgesia. 94. 1389-1395 (2002)

S.Nakamura、K.Sugahara 等人：“GABA 药物对吗啡引起的大鼠脊髓缺血非损伤性间歇期痉挛性截瘫的影响”麻醉

J.Tokumine, K.Sugahara, et al.: "Spinal GDNF level is increased after transient spinal cord ischemia in the rat"Acta Neurochirurgica Suppl. 85(in press). (2003)

J.Tokumine、K.Sugahara 等人：“大鼠短暂脊髓缺血后脊髓 GDNF 水平升高”Acta Neurochirurgica Suppl.

K.Sugahara, et al.: "Effects of vitamin A and growth factors on hypoplastic lungs in congenital diaphragmatic hernia in rats"Molecular Biology of the Cell. 13. 532a-532a (2002)

K.Sugahara 等人：“维生素 A 和生长因子对大鼠先天性膈疝肺发育不良的影响”细胞分子生物学。