培養肺胞上皮細胞気管内注入による肺病変修復促進の分子生物学的検索-水腫液吸収促進および人工サーファクタント併用による障害後細胞注入効果

气管内注射培养肺泡上皮细胞促进肺病灶修复的分子生物学研究-损伤后细胞注射促进水肿液吸收与人工表面活性剂联合作用

基本信息

批准号：
09877308
负责人：
須加原一博
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.培養肺胞II型上皮細胞気管内投与による投与細胞の動態-ラット肺より肺胞II型上皮細胞を分離し、細胞が培養皿に付着しないようにバクテオロジカルデイシュに一日培養。この時細胞機能を維持するため、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘍細胞外マトリックスをLab Techを用いて培養液中に浸して保持し、4-diamino-2-phenylindole(DAPl)を用いて細胞核を染色してから他のラット肺に気管内投与した。数日後ラット肺を凍結固定し、凍結切片を作成して蛍光顕微鏡にて観察すると投与した細胞が塊を作って肺胞壁に付着しており、形態的に以前の方法より活性の高い生きた細胞が確認された。DAPlでは凍結切片が必要なため、lipophilicdialkylcarbocyanines(Dil or DiD)を用いて、培養細胞を染色し気管内投与し、組織をパラホルムアルデハイドで固定し観察。投与細胞と組織細胞の区別が充分可能なことを確認できた。培養細胞を肺胞上皮細胞増殖因子であるKGFで、12時間刺激しDAPlあるいはDilで染色後、気管内投与してその動態を検索し、同様の結果を得ている。少し細胞障害があると思われるため、染色しない培養細胞を気管内投与し、投与肺を組織学的、電顕的に検索している。2.呼吸不全動物肺での細胞形態変化-エンドトキシン、ブレオマイシンや塩酸による障害ラットを作製し、KGFで刺激した培養肺胞II型上皮細胞を呼吸不全動物ラット肺に気管内投与し、その投与細胞の動態を検索しているが、肺水腫などが強いためか肺胞壁まで達していなく付着した細胞が少ない。最適投与時期を検索するため、経時的な変化を観察したが、4〜7日頃に投与した方が付着細胞は多いようだ。障害が進行しているため、付着細胞が脱落するのも観察された。3.KGF刺激培養肺胞上皮細胞と人工サーファクタント併用による肺障害抑制効果-肺障害後早期に人工サーファクタントを投与しその後培養細胞を投与すると付着細胞の増加がみられ、障害修復の促進が期待され現在検索中である。4.今後の展望-肺障害作製後人工呼吸管理を併用して(初期の肺水腫を抑えて)KGF刺激培養細胞を投与する研究も進行している。さらに、アデノウイルスを用いたgene transferによる研究も検討し始めている。

1.气管内给药培养的肺泡II型上皮细胞的动态-从大鼠肺部分离肺泡II型上皮细胞，并在细菌培养皿中培养1天，以防止细胞粘附在培养皿上。此时，为了维持细胞功能，使用Lab Tech将Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤细胞外基质浸入培养基中，并使用4-二氨基-2-苯基吲哚（DAP1）对细胞核进行染色。然后气管内给药至其他大鼠的肺部。几天后，将大鼠肺冷冻固定，制备冰冻切片，并在荧光显微镜下观察，施用的细胞形成团块并粘附在肺泡壁上，表明它们在形态上比之前的方法更活跃。被证实。由于DAP1需要冷冻切片，因此用亲脂性二烷基碳花青(Dil或DiD)对培养的细胞进行染色并气管内施用，并且用多聚甲醛固定组织并观察。确认可以充分地区分施用的细胞和组织细胞。通过用KGF(一种肺泡上皮细胞生长因子)刺激培养的细胞12小时，用DAP1或Dil染色，并气管内施用细胞以检查它们的动态，获得了类似的结果。由于似乎存在一些细胞损伤，因此将未染色的培养细胞注入气管内，并对肺部进行组织学和电子显微镜检查。 2.呼吸衰竭动物肺部的细胞形态变化——我们制作了内毒素、博莱霉素和盐酸引起病变的大鼠，将培养的用KGF刺激的肺泡II型上皮细胞气管内给予呼吸衰竭动物的肺部我们正在寻找肺泡的动态，但可能是由于强烈的肺水肿，细胞没有到达肺泡壁，贴壁细胞很少。为了找到最佳的给药时机，我们观察了随时间的变化，似乎在第 4 至 7 天左右给药时有更多的贴壁细胞。随着损伤的进展，还观察到贴壁细胞脱落。 3. KGF刺激的培养肺泡上皮细胞与人工表面活性剂组合对肺损伤的抑制作用 - 当肺损伤后早期施用人工表面活性剂并随后施用培养细胞时，观察到贴壁细胞的增加，这有望促进损伤目前正在寻找中。 4. 未来展望 - 研究还在肺损伤后联合人工呼吸管理（抑制最初的肺水肿）施用 KGF 刺激的培养细胞。此外，我们开始考虑使用腺病毒进行基因转移的研究。