子宮内発育不全発症機序に関する分子生物学的研究-妖精症をモデルとして

宫内生长受限发病机制的分子生物学研究——以仙女病为模型

基本信息

批准号：
07670830
负责人：
藤枝憲二
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

I)同定されたインスリン受容体コドン87のLeucineからProlineへの変異がインスリンの生物学的作用に影響を及ぼすかどうか検討するため我々は異常インスリン受容体(Pro87IR)cDNA発現ベクターを構築し、NIH3T3細胞へ遺伝子導入し、stable cloneを得、正常型インスリン受容体(Leu87IR)と比較した。(1)[_<35>S]methionineによるmetabolic labelingによりPro87IRは、proreceptorのdimer化に遅れを認めるが、cell surface biotinylationでは細胞表面にα,β-subunitとして認められるため、細胞内輸送には大きな影響を及ぼさないことが示された。(2)Scatchard plot解析によりPro87IRのインスリン結合親和性はLeu87IRの約15%に低下し、dissociation kineticsにおいてもインスリンのPro87IRからの解離は亢進し、Pro87IRにおけるインスリン結合親和性の低下が確認された。(3)Pro87IRβ-subunitのインスリン刺激による自己リン酸化は、Leu87IRに比べ低下しており、インスリンの生物学的作用の減弱を来していると考えられた。II)受容体におけるコドン87の機能を解析するために同部位のsite-directed mutagenesisを施行した。(1)変異型インスリン受容体(Ile87,Val87,Ala87IR)cDNA発現ベクターを構築し、NIH3T3細胞に遺伝子導入し、stable cloneを得た。(2)cell surface biotinylationにより各変異型受容体が細胞膜表面に到達することを確認した。(3)Scatchard plot解析により、Ile87,Val87IRでは結合親和性がLeu87IRの約4倍に、Ala87IRでは約15%に低下しており、dissociation kineticsにおいても、Ile87,Val87IRではインスリンの解離の遅延が、Ala87IRでは解離の亢進が認められた。(4)各変異受容体の自己リン酸化は結合親和性に比例し、Ile87,Val87IRでは濃度依存性に増加し、Ala87IRでは低下していた。以上から、コドン87はインスリン結合に直接結合しており、さらに同部位にはLeuのγ-branched side chainよりもIle,Valのβ-branched side chainの方が適していることが示された。

I) 为了研究已鉴定的胰岛素受体密码子87从亮氨酸变为脯氨酸的突变是否影响胰岛素的生物学效应，我们构建了异常胰岛素受体（Pro87IR）cDNA表达载体，并将该基因导入细胞，获得稳定克隆，并与正常胰岛素受体（Leu87IR）进行比较。 (1)[_35S]蛋氨酸代谢标记显示Pro87IR在前受体二聚化中被延迟，但在细胞表面生物素化中，Pro87IR在细胞表面被识别为α,β-亚基，因此难以在细胞内转运结果表明，对细胞没有显着影响。 (2)Scatchard图分析表明，Pro87IR的胰岛素结合亲和力降低至Leu87IR的约15%，并且胰岛素从Pro87IR的解离动力学加速，证实Pro87IR的胰岛素结合亲和力降低。 (3)胰岛素刺激的Pro87IRβ亚基的自身磷酸化低于Leu87IR，表明胰岛素的生物学效应减弱。 II)为了分析受体中密码子87的功能，对同一位点进行了定点诱变。 (1)构建突变型胰岛素受体(Ile87、Val87、Ala87IR)cDNA表达载体，并将该基因导入NIH3T3细胞，获得稳定克隆。 (2)细胞表面生物素化证实各突变受体均到达细胞膜表面。 (3)Scatchard图分析显示Ile87、Val87IR的结合亲和力约为Leu87IR的4倍，Ala87IR的结合亲和力约为15%，从解离动力学来看，Ile87、Val87IR显示胰岛素解离被延迟。在 Ala87IR 中观察到解离。 (4) 每个突变受体的自磷酸化与结合亲和力成正比，Ile87 和 Val87IR 浓度依赖性增加，Ala87IR 减少。由上可知，密码子87与胰岛素结合直接相关，Ile和Val的β分支侧链比Leu的γ分支侧链更适合同一位点。