哺乳動物脳のニューロフィラメントキナーゼの精製とその性質

哺乳动物脑神经丝激酶的纯化和性质

基本信息

批准号：
04833006
负责人：
久永眞市
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

神経細胞に特異的な中間径繊維であるニューロフィラメントは、神経細胞内で最もリン酸化されている蛋白の一つである。しかし、ニューロフィラメントをリン酸化しているキナーゼについては全く解っていない。本研究では、脱リン酸化したNF蛋白を基質として、ブタ脳からニューロフィラメントのHサブユニット(NFH)を選択的にリン酸化するキナーゼを精製した。ブタ脳から微小管を重合させ、遠心分離したところ、ほとんどのNFHキナーゼ活性は微小管と共に沈澱分画に回収された。NFHキナーゼを微小管分画から高塩濃度溶液で抽出した後、DEAE、ハイドロキシアパタイト、硫安分画、Superose6によるゲルロ過、MonoQ、SPイオン交換の各カラムクロマトグラフィーを通すことにより高度に精製した。最終精製過程による活性とSDS-PAGEによる蛋白の挙動を調べることにより32Kと25Kの2つのサブユニットから成っていることが示された。NFHキナーゼはニューロフィラメントの3つのサブユニットのうち脱リン酸化されたNFHを最もよい基質とした。NFHのin vivoのリン酸部位に対する抗体を用いてブロッティングしたところ、NFHキナーゼによるリン酸化で、抗原性が回復し、NFHキナーゼがNFHのin vivoのリン酸化部位をリン酸化していることが示された。キナーゼの基質としてよく知られている蛋白をいくつか基質として調で、ヒストンH1がよい基質であることが解った。ヒストンH1キナーゼとして知られているcdc2キナーゼとの関連を調べたるため、抗PSTAIR抗体でブロッティングしたが、いずれのサブユニットにも反応しなかった。しかし、cdc2キナーゼと特異的に結合的に結合する酵母のsuc1蛋白とはcdc2キナーゼと同様に結合した。NFHKは神経細胞に特異的なcdc2に関連したキナーゼであると推測された。

神经丝是神经细胞特有的中间纤维，是神经细胞内磷酸化程度最高的蛋白质之一。然而，人们对磷酸化神经丝的激酶知之甚少。在这项研究中，我们使用去磷酸化的 NF 蛋白作为底物，纯化了一种能够选择性磷酸化猪脑神经丝 H 亚基 (NFH) 的激酶。当微管从猪脑聚合并离心时，大部分 NFH 激酶活性与沉淀部分中的微管一起恢复。用高盐浓度溶液从微管级分中提取NFH激酶，然后通过DEAE、羟基磷灰石、硫酸铵分级、Superose6凝胶过滤、MonoQ和SP离子交换柱层析进行高度纯化。通过检查最终纯化过程中的活性以及通过 SDS-PAGE 检测蛋白质的行为，结果表明它由两个亚基组成：32K 和 25K。在神经丝的三个亚基中，去磷酸化的NFH是NFH激酶的最佳底物。当使用针对NFH的体内磷酸化位点的抗体进行印迹时，由于NFH激酶的磷酸化而恢复了抗原性，这表明NFH激酶使NFH的体内磷酸化位点磷酸化。我们研究了几种众所周知的激酶底物蛋白质，发现组蛋白 H1 是一种很好的底物。为了研究与 CDC2 激酶（称为组蛋白 H1 激酶）的关系，我们用抗 PSTAIR 抗体进行印迹，但它不与任何亚基发生反应。然而，它与酵母 suc1 蛋白的结合类似，后者特异性结合 CDC2 激酶。 NFHK 被推测是一种神经元特异性 CDC2 相关激酶。